Summary
A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos. Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em um espaço de referência dado
Abstract
O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a compreensão dos processos normais de funcionamento e as doenças do cérebro humano. Estereologia imparciais, o método aceito como o estado-da-arte para a quantificação de objetos biológicos em cortes de tecido
Protocol
Parte 1: Pré-processamento de tecido deve ser feito de acordo com Burke et al. (2009) 5.
- Resumidamente, o tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeyhde, gluteraldehyde, ou formol. O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesados, determinado volume, cryoprotected, e congelados 5.
Parte 2: amostragem sistemática de tecido, de acordo com Burke et al. (2009) 6.
- Neste exemplo, focada no lobo frontal do cérebro vervet. O espaço de referência foi definido para incluir tecido cortical do sulco central do pólo frontal do hemisfério esquerdo. Para os nossos propósitos da série foram fixados em 1 / 10 seções em todo o córtex, seccionados a 50 ìm. Uma série completa foi manchada com violeta cresil (série # 1). Série 2 foi dividido de modo que metade dos cortes foram corados com o cloreto de ouro para mielina revelação e manchado outra metade para esterase acetilcolina (para a delimitação de certas áreas subcortical). Todas as outras séries foram bancados em preservar o antígeno como parte de nossos planos de investigação a longo prazo.
Parte 3: Estereologia (para mais detalhes, veja Mouton 2002) 4
- A estimativa total de número de células (N) é calculado com base na seguinte equação:
N = ssf -1 x -1 x asf tsf -1 x Σ Q -
Ssf onde é a fração de amostragem seção, asf é a fração de amostragem área, tsf se a fração de amostragem espessura (onde a espessura medida do tecido é dividido pela altura dissector), e Σ Q - é o número total de objetos de interesse contados dentro do dissector. As próximas seções deste protocolo mostrar como determinar a ssf, asf, tsf e Σ Q. - Fração seção de amostragem (computador não-based)
- O espaço de referência inteiro deve ser bem definida no sentido antero-posterior e dorsal para ventral. Neste exemplo, estavam interessados no lobo frontal ea definiu como a região da ponta do pólo frontal (anterior) ao sulco central (posterior) eo sulco lateral (ventral) e excluiu a ínsula.
- Para o lobo frontal deste assunto em particular um total de 760 seções foram sistematicamente coletados com 76 manchada por violeta cresil. Uma vez que o alvo era de 10 seções em todo o espaço de referência 06/01 seções violeta cresil manchadas foram amostradas, levando a uma fração amostral Seção de cerca de 1 / 60. Aleatoriamente começou com um dos primeiros seis cortes corados cresil violeta e sistematicamente amostrados 1 / 6 depois. Um total de 13 seções foram amostradas para o tema selecionado (Figura 2).
Fração de área da amostra (computer-based)- Um estudo piloto vai indicar o tamanho da grade ideal, a fração de amostragem de Área, a amostra do espaço de referência com cerca de 100-300 disectors. No lobo frontal, um tamanho de grade de 2500 mM dois renderam uma média de 254 disectors para este assunto (Figura 2). O tamanho da disector deve render entre cerca de 0-5 objetos contados, neste caso, os neurônios.
- Fração da espessura da amostra (computer-based)
- Em cada local disector, a altura do tecido é medida, e uma fração desta altura é amostrado, o que é conhecido como a fração de amostragem de espessura. Para determinar a espessura medida, o foco através do z-plano até que a primeira célula entra em foco, em seguida, volta-se ligeiramente para o topo da seção, ou seja, até o último objeto aparece logo fora de foco. Para determinar o fundo do tecido, o foco através do z-plano até que as células são pouco fora de foco.
- Focando através do z-plano, as células devem ser coradas em cada profundidade, se não, isso pode indicar uma penetração incompleta da desidratação mancha ou não-uniforme do tecido, caso em que as seções devem ser re-marcados. Esta precaução é especialmente importante para o tecido imunocoradas que requer penetração de immunoprobes através de seções de tecido relativamente grossa. Por esta razão, o tecido deve ser leve imunocoradas contracorados com uma mancha basofílico (violeta, por exemplo, cresil, hemahematoxilina), a fim de determinar com precisão superior e inferior da seção e para confirmar a penetração do anticorpo. Neste estudo, os cortes foram cortados em um micrótomo configuração de 50 ìm. Após todo o processamento de tecidos estava completa, a espessura do tecido medido em média 17.9μm (Figura 2), com uma retração média de cerca de 65%. Note-se que estes resultados representam o encolhimento do tecido típico para processadas para preparação histológica de rotina 7.
- A altura disector padrão para o estudo típico é 10μm. A diferença entre a altura ea espessura disector seção medida é a altura de guarda, o volume de tecido onde não características biológicas são contados. O uso de uma altura de guarda evita dano tecidual nas superfícies de corte (por exemplo, perdeu caps).
- O número total de objetos contados, Σ Q -
- Para evitar viés de erros de reconhecimento, é imperativo que uma definição padrão é seguido para o recurso especial de interesse biológico. Neste caso, estávamos interessados em contar os neurônios. Portanto, um neurônio foi definido como tendo um nucléolo visível uma localização central e um citoplasma bem definido, enquanto que as células da glia, geralmente faltava nucléolos visíveis e citoplasma. Para este assunto 457 neurônios foram contados.
Parte 4: Stereologer - Um Sistema de Estereologia computadorizada (Estereologia Resource Center, Chester, MD)
- O Sistema Stereologer pede ao utilizador para preencher as informações necessárias de forma passo-a-passo. No "Estudo seção" Informações sobre os parâmetros do estudo são estabelecidas. Desde um espaço de referência deve ser definido para o estudo, o parâmetro de volume deve ser selecionado (para o espaço de referência do estimador Cavalieri deve ser selecionado). Volume de objeto também pode ser selecionado aqui para estimar o número ponderado de volume para a população de objetos de interesse. Para o nosso exemplo, apenas o volume do espaço de referência foi selecionado. Para cada objeto, selecione o número e definir a característica de interesse, neste caso neurônios.
- Inicialização caso: Nesta seção as informações de amostragem é estabelecido. Digite o intervalo de amostragem de placas (lajes se separar de tecido foram cortados de forma exaustiva e cada seção é colocado na ordem seqüencial em seguida, digite um aqui). Digite o número total de seções tomadas através do espaço de referência (neste caso 760). Em seguida, insira o intervalo de amostragem seção (neste caso 59). O sistema calcula o número de seções devem ser amostrados (neste caso 13).
- Parâmetros da sonda: Esta seção define a grade e tamanho disector. Para o volume, use uma baixa ampliação 2.5x-10x para definir o espaçamento da grade, no menu de edição. Ampliação de objeto deve ser realizada em 100x (NA 1.3 ou 1.4). Área do quadro é o tamanho do disector, neste caso usamos 50% da tela. A altura do quadro é a espessura do disector; fixado em 10μm aqui. O espaçamento é o tamanho da grade. Em nosso estudo piloto verificou-se que 2500μm rendimentos entre 150-200 frames espaçados de forma sistemática uniforme através de um espaço de referência relativamente grande. Para áreas menores, um tamanho menor da grade deve ser usada. Um estudo piloto irá identificar os parâmetros de sensor óptico para cada estudo particular.
- Uma vez que os parâmetros do estudo foram estabelecidos, a amostragem através do tecido pode prosseguir. O programa irá solicitar que você experimentar a primeira seção. Passo 1: O programa irá solicitar ao usuário, em pequeno aumento, para traçar o espaço de referência na seção. O sistema em seguida, coloque uma grade sobre a seção com base nos parâmetros da sonda eo usuário irá então verificar que aponta queda no espaço de referência. Se um ponto não está dentro do espaço de referência basta clicar sobre o ponto e não será calculado para o volume. Passo 2: O sistema irá colocar uma nova grade sobre o espaço de referência, com base nos parâmetros espaçamento. Verifique se as interseções se inserem no espaço de referência. Passo 3: O sistema irá solicitar que o usuário alterne para o objetivo maior ampliação e mover o palco para o primeiro dissector. Etapa 4: Neste ponto, o sistema avisa o usuário para definir o superior e inferior da seção, em seguida, o sistema define o espaço de amostragem no eixo z Passo 5:. O usuário clique em cada objeto que cai dentro do disector através do z-plano. Objetos que tocam as linhas vermelhas ou a parte inferior da disector não podem ser contabilizadas. Uma vez que cada objeto é contado, clique em Avançar. O estágio irá se mover para a próxima disector e os passos 4 e 5 serão repetidos. Depois de todos os disectors para a seção foram contabilizados, o sistema irá solicitar que o usuário insira a próxima seção seqüencial a ser sondado. Passos 1-5 será repetido até que todas as seções seqüenciais têmforam amostrados. O sistema irá fornecer os cálculos para asf, ssf, tsf, e Q Σ. Com base nesses parâmetros, o sistema irá gerar um N estimada, volume de referência e CE para tanto o número estimado e volume. Ele também lhe dará recomendações para se tornar mais eficientes ou para reduzir a CE (Figura 2).
Parte 5: Resultados Representante:
Estereologia imparcial fornece estimativas eficiente e confiável de populações de células dentro de um espaço de referência. Há um número de sistemas baseados em computadores estereológica disponíveis, todos que dependem de amostragem sistemática e um espaço de referência definido. Nós temos usado o sistema de BIOQUANT Vida Ciências para estimar o total da população neuronal do córtex cerebral de 2 anos de idade vervet em mais de 828 milhões (Figura 3) com uma média de 0,042 CE. Temos posteriormente utilizado o sistema Stereologer estimar que as contas do lobo frontal por cerca de metade do número de neurônios corticais 8.
Figura 1 Computador sistemas baseados em Estereologia. O set-up básico dos sistemas de estereologia é o mesmo, um microscópio com um palco motorizado (xyz), um controlador de palco, câmara de vídeo, computador e software. O sistema que é em última análise, devem ser escolhidos com base na eficiência, necessidades e análise de custos.
| INFORMAÇÃO ESTUDO | |
| Nome estudo | Frontal Cortex |
| Investigador Principal | MB |
| Espécies | AG |
| Espaço de referência Frontal | Córtex |
| Notas | |
| Informações sobre o caso | |
| Coletor de Dados | MB |
| Data | Quarta-feira, 30 de abril, 2008 |
| Grupo | Controle |
| Assunto | O26 |
| Notas | |
| CARACTERÍSTICAS DE AMOSTRAGEM | |
| Intervalo de amostragem laje | 1 |
| Número total de seções | 760 |
| Intervalo de amostragem seção | 59 |
| Seção de partida | 2 |
| FRAÇÕES | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| RESUMO RESULTADOS | |||||
| Parâmetro | Sondar | Nome | Resultado | CE | SD |
| Espessura | --- | --- | 17,8996 μ | --- | --- |
| Número | Disector | neurônio | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Volume | Cavalieri ponto da grade | volume | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| RECOMENDAÇÕES | |
| Sondar | Número objeto (neurônio) |
| CE | 0,0474 |
| Recomendações | CE é aceitável. |
| Número de Disectors Vista é muito alto, aumentar o espaçamento disector. | |
| Sondar | Volume região (volume) |
| CE | 0,0078 |
| Recomendações | CE é aceitável. |
| RESULTADOS SEÇÃO | ||
| Seção | neurônio NumObjects neurônio NumCorners | RegPoints volume de |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Figura 2 Os resultados do Lobe fontal obtidas com o sistema Stereologer. Para o lobo frontal, a maior parte do processo de estereológica foi na amostragem sistemática e de corte. Estimar o volume, topografia e neuronal foram concluídas em cerca de um dia para cada assunto. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios.
Figura 3 Cortex Estimativa da População Neuronal Obtidos com BIOQUANT. BIOQUANT O sistema requer uma topografia exata antes da contagem das células. Aqui uma média de 13 cortes foram amostrados. Topografia cortical e estimativa de volume subseqüente levou entre 15-20 horas para cada disciplina. Topografia foi realizada sob um objetivo 2.5x e contando foi feito usando uma objetiva de imersão 100x óleo (NA 1.3). Cada seção 100 foi escolhido por todo o hemisfério esquerdo, com uma média de 180 disectors amostrados. Uma vez que a topografia foi concluída a contagem neuronal demorou cerca de um dia. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios.
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Discussion
Estereologia imparcial em um cérebro de primatas é semelhante ao de outras amostras biológicas. No entanto, dado o tamanho do cérebro dos primatas, um plano de tratamento cuidadoso é recomendado desde um único hemisfério do macaco vervet produz mais de 1.200 seções quando cortado em 50 micra. Em primeiro lugar recomendamos stereotaxically bloqueando o cérebro em blocos de um centímetro, que fornece um plano padrão de seção entre os blocos e assuntos, minimiza seções parcial entre blocos, e fornece blocos gerenciáveis de tamanho 5. Um passo crucial para a estereologia é a amostragem sistemática de tal forma que as seções 60-10 são obtidos através da área de referência. Para o cérebro dos primatas, isto deixa uma quantidade significativa de matérias não transformadas, assim, a fim de maximizar o potencial de dados obtidos em cada cérebro sugerimos bancário do tecido em antígeno preservar para os planos de investigação a longo prazo 6. Quando o tecido é depositado, uma abordagem sistemática para identificar imunodetecção proteínas-alvo no cérebro de macaco pode ser preparado para estereologia 9. Áreas maiores, como o córtex ou os lobos podem exigir 14/10 seções, assim, previamente à realização de um plano deve ser feito para ter pelo menos 10 secções através do menor espaço de juro de referência em potencial. Um estudo piloto também deve ser realizada sobre um assunto de controle para definir os parâmetros para o estudo estereológico. Além disso, ao apresentar ou interpretar dados publicados estereológica o asf, tsf, ssf, e Σ Q devem ser comunicados juntamente com os valores apropriados CE.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico. NSERC conceder ao MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
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- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
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- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
