Summary
De anatomische organisatie van het primaat hersenen kan belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens. Onpartijdige stereology is een methode voor het nauwkeurig en efficiënt schatting van het totaal aantal neuron (of een ander celtype) in een bepaalde referentie-ruimte
Abstract
De niet-menselijke primaat is een belangrijk translationeel soort voor het begrijpen van de normale functie en ziekteprocessen van het menselijk brein. Onbevooroordeelde stereology, de methode geaccepteerd als state-of-the-art voor de kwantificering van biologische objecten in weefselcoupes
Protocol
Deel 1: Pre-verwerking van weefsel moet worden gedaan op basis van Burke et al.. (2009) 5.
- In het kort, moet weefsel goed geperfuseerd met paraformaldehyde, glutaaraldehyde, of formaline. Dit kan worden bereikt door middel van standaard transcardial perfusie meestal gebruikt om andere organen te oogsten. In de huidige studie het onderwerp was diep gesedeerd met ketamine hydrochloride (10 mg / kg, im), gedood met een overdosis natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) en perfusie transcardially met 0,1 M PBS tot het volledig exsanguinated. Dit wordt gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing in PBS gedurende 5 minuten (~ 1 liter). Weefsel moet goed worden geperfuseerd met paraformaldeyhde, gluteraldehyde of formaline. De hersenen moeten stereotaxically worden geblokkeerd, verwijderd uit de schedel, gewogen, volume bepaald cryoprotected, en bevroren 5.
Deel 2: Systematische Bemonstering van weefsel, volgens Burke et al.. (2009) 6.
- In dit voorbeeld hebben we ons gericht op de frontale kwab van de hersenen vervet. De referentie ruimte werd gedefinieerd als corticale weefsel van de centrale sulcus aan de frontale pool van de linker hersenhelft te nemen. Voor onze doeleinden de serie werden vastgesteld op 1 / 10 secties in de cortex, doorsnede bij 50μm. Een complete serie werd gekleurd met cresyl violet (serie # 1). Serie 2 is gesplitst, zodat de helft van de secties werden gekleurd met goud chloride voor myeline openbaring en de andere helft gekleurd voor acetylcholine-esterase (voor de afbakening van bepaalde subcorticale gebieden). Alle andere series werden opgespaarde in antigeen te behouden als onderdeel van onze lange-termijn onderzoek plannen.
Deel 3: Stereology (voor meer details, zie Mouton 2002) 4
- De totale schatting van het aantal cellen (N) wordt berekend op basis van de volgende vergelijking:
N = SSF -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q -
Waar SSF is de sectie bemonstering fractie, asf is het gebied sampling fractie, TSF als de dikte van bemonstering fractie (waar de gemeten dikte van het weefsel wordt gedeeld door de dissector hoogte), en Σ Q - is het totale aantal objecten van de getelde belang binnen de dissector. De volgende paragrafen van dit protocol te laten zien hoe de SSF, asf, TSF en Σ Q te bepalen. - Sectie Sampling Fraction (niet-computer based)
- Het gehele desbetreffende ruimte moet goed gedefinieerd worden vanuit anterior naar posterior en dorsaal van ventrale. In dit voorbeeld hebben we geïnteresseerd waren in de frontale kwab en hebben gedefinieerd als de regio van de punt van de frontale pool (anterior) naar de centrale sulcus (posterior) en de laterale sulcus (ventrale) en uitgesloten de insula.
- Voor de frontale kwab van dit onderwerp een totaal van 760 secties werden systematisch verzameld met 76 gekleurd voor cresyl violet. Aangezien het doel was 10 secties in de referentie-ruimte 1 / 6 cresyl violet gekleurde coupes werden bemonsterd, wat leidt tot een Sectie Sample fractie van ongeveer 1 / 60. We willekeurig begonnen met een van de eerste zes cresyl violet gekleurde coupes en systematisch bemonsterd 1 / 6 daarna. Een totaal van 13 secties werden bemonsterd voor het geselecteerde onderwerp (figuur 2).
Gebied Sample Fraction (computer-based)- Een pilot studie geeft de optimale grid grootte, de Area Sampling Fraction, de referentie-ruimte monster met ongeveer 100-300 disectors. Binnen de frontale kwab, een raster van 2500 um twee leverden een gemiddelde van 254 disectors voor dit onderwerp (figuur 2). De grootte van de disector moet opleveren tussen ongeveer 0-5 geteld objecten, in dit geval, neuronen.
- Dikte Sample Fraction (computer-based)
- Op elke locatie disector, is de hoogte van het weefsel gemeten, en een fractie van deze hoogte is bemonsterd, dit staat bekend als de dikte Sampling fractie. Voor het bepalen van de gemeten dikte, focus door de z-vlak tot aan de eerste cel komt in beeld, dan weer iets omhoog naar de top van de sectie, dat wil zeggen, tot het laatste object verschijnt net buiten focus. Voor het bepalen van de onderkant van het weefsel, focus door de z-plane totdat de cellen zijn nauwelijks onscherp.
- Scherpstellen door de z-vlak, moeten cellen worden gekleurd op elke diepte, zo niet, dit kan een onvolledige penetratie van de vlek of niet-uniforme uitdroging van het weefsel aan te geven, in welk geval de onderdelen opnieuw worden gekleurd. Deze voorzorgsmaatregel is vooral belangrijk voor immunostained weefsel dat de penetratie van immunoprobes vereist door de relatief dikke weefselcoupes. Om deze reden moet immunostained weefsel licht worden tegengekleurd met een basofiele vlek (bijv. cresyl violet, hematoxylin) om nauwkeurig te bepalen boven-en onderkant van de sectie en de penetratie van het antilichaam te bevestigen. In deze studie werden de secties gesneden met een microtoom instelling van 50μm. Nadat alle weefsels verwerking is voltooid, wordt de gemeten weefseldikte gemiddeld 17.9μm (figuur 2), met een gemiddelde krimp van ongeveer 65%. Merk op dat deze resultaten typische krimp vertegenwoordigen voor weefsel verwerkt voor routine histologische preparaat 7.
- De standaard disector hoogte voor de typische studie is 10μm. Het verschil tussen de disector hoogte en de gemeten sectie dikte is de wacht hoogte, het volume van het weefsel waar geen biologische kenmerken worden geteld. Het gebruik van een bewaker hoogte voorkomt weefselschade aan het snijden oppervlakken (bijv., verloren caps).
- Het totaal aantal objecten geteld, Σ Q -
- Om te voorkomen dat vooroordelen van herkenning fouten, is het noodzakelijk dat een standaard definitie wordt gevolgd voor de specifieke biologische functie van belang. In dit geval zijn we geïnteresseerd waren in het tellen van neuronen. Daarom werd een neuron gedefinieerd als een zichtbare centraal gelegen kernlichaampje en een duidelijk omschreven cytoplasma, terwijl gliacellen in het algemeen ontbrak zichtbaar nucleoli en cytoplasma. Voor dit onderwerp 457 neuronen werden geteld.
Deel 4: Stereologer - een geautomatiseerd Stereology Systeem (Stereology Resource Center, Chester, MD)
- De Stereologer systeem vraagt de gebruiker invullen van de benodigde informatie in een stap-voor-stap manier. In de "Studie Informatie" sectie van de parameters van de studie zijn gevestigd. Aangezien een referentie ruimte moet worden gedefinieerd voor de studie, moet het volume parameter worden geselecteerd (voor de referentie-ruimte de Cavalieri schatter moet worden geselecteerd). Object volume kan hier ook worden gekozen om het aantal gewogen volume voor de bevolking van objecten van belang te schatten. Voor ons voorbeeld, was alleen het volume van de referentie-ruimte geselecteerd. Voor elk object, selecteert u het nummer en definieer de functie van belang, in dit geval neuronen.
- Case Initialisatie: In deze paragraaf worden de steekproef wordt opgericht. Voer de plaat sampling interval (als aparte platen van weefsel werden uitvoerig in plakken gesneden en elk hoofdstuk is geplaatst in de juiste volgorde en voer vervolgens een hier). Geef het totaal aantal secties genomen door de referentie-ruimte (in dit geval 760). Voer vervolgens het hoofdstuk sampling interval (in dit geval 59). Het systeem berekent dan het aantal afdelingen te bemonsteren (in dit geval 13).
- Probe Parameters: In dit hoofdstuk bepaalt de grid en disector grootte. Voor het volume, gebruik een lage vergroting 2.5x-10x aan het net afstand definiëren onder het menu Bewerken. Object vergroting dient te worden uitgevoerd bij 100x (NA 1.3 of 1.4). Frame gebied is de grootte van de disector, in dit geval gebruiken we 50% scherm. Het frame hoogte is de dikte van de disector, vastgesteld op 10μm hier. Het frame afstand is de grootte van het raster. In onze pilot-studie vonden we dat 2500μm rendementen tussen de 150 tot 200 frames verdeeld in een systematisch-uniforme wijze door middel van een relatief groot referentie-ruimte. Voor kleinere gebieden, moet een kleinere grid grootte worden gebruikt. Een pilot studie zal identificeren van de optische sensor parameters voor ieder afzonderlijk onderzoek.
- Zodra de studie parameters zijn vastgesteld, kunnen de monsters door het weefsel door te gaan. Het programma vraagt u naar de eerste sectie monster Stap 1:. Het programma zal de gebruiker gevraagd, onder lage vergroting, met de referentie-ruimte te traceren op de sectie. Het systeem zal een rooster en plaats over het deel dat gebaseerd is op de sonde parameters en de gebruiker zal dan controleren of die punten onder de referentie-ruimte. Als een punt wordt niet door het referentiebedrag ruimte klikt u op het punt en zullen niet worden doorberekend in de volume. Stap 2: Het systeem zal een nieuw raster plaats over de referentie-ruimte, op basis van de spantafstand parameters. Controleer of de kruispunten onder de referentie-ruimte. Stap 3: Het systeem zal dan vraagt de gebruiker om te schakelen naar de hogere vergroting doel en de fase over te gaan naar de eerste dissector. Stap 4: Op dit punt vraagt het systeem de gebruiker te definiëren de boven-en onderkant van de sectie zal het systeem stelt de bemonstering ruimte in de z-as Stap 5:. De gebruiker zal dan klikt u op elk object dat binnen de disector valt door de z-vlak. Voorwerpen die de rode lijnen of de onderkant van de disector aanraking mogen niet worden geteld. Zodra elk object wordt geteld, klik op volgende. Het podium gaat naar de volgende disector en stap 4 en 5 zal worden herhaald. Zodra alle disectors voor de sectie zijn geteld, zal het systeem de gebruiker wordt gevraagd de volgende sequentiële sectie wordt ingevoegd te worden gepeild. Stappen 1-5 zal worden herhaald totdat alle van de sequentiële secties hebbenzijn bemonsterd. Het systeem zal dan voorzien in de berekeningen voor asf, SSF, TSF, en Σ Q. Op basis van deze parameters, zal het systeem een geschatte N, referentie-volume en de CE's voor zowel het geschatte aantal en volume. Het zal ook aanbevelingen doen om efficiënter te worden of om de CE (figuur 2) te verminderen.
Deel 5: representatieve resultaten:
Onpartijdige stereology biedt efficiënte en betrouwbare schattingen van celpopulaties binnen een referentie-ruimte. Er zijn een aantal van computer-based stereological systemen beschikbaar, die alle vertrouwen op een systematische bemonstering en een gedefinieerde referentie-ruimte. We hebben de BioQuant Life Sciences systeem om de totale neuronale bevolking van de cerebrale cortex van 2-jaar-oude meerkatten schatten op meer dan 828 miljoen (figuur 3) met een gemiddelde van 0.042 CE. We hebben vervolgens gebruikt het systeem om Stereologer schatten dat de frontale kwab is goed voor ongeveer de helft van het aantal corticale neuronen 8.
Figuur 1 Computer-based Stereology systemen. De basis set-up van de stereology systemen is hetzelfde, een microscoop met een gemotoriseerde fase (xyz), een podium controller, videocamera, computer en software. Het systeem dat uiteindelijk wordt gekozen moet worden gebaseerd op efficiëntie, behoeften en kosten analyse.
| Studie-informatie | |
| Studie Naam | Frontale cortex |
| Principal Investigator | MB |
| Soorten | AG |
| Referentie Space Frontale | Schors |
| Opmerkingen | |
| CASE INFORMATIE | |
| Data Collector | MB |
| Datum | Woensdag de 30 april 2008 |
| Groep | Controle |
| Onderwerp | O26 |
| Opmerkingen | |
| Steekproefkenmerken | |
| Slab Sampling Interval | 1 |
| Totaal aantal secties | 760 |
| Sectie Sampling Interval | 59 |
| Beginnend Sectie | 2 |
| FRACTIES | |
| ASF | 0.0002 |
| SlabSF | 1.0000 |
| SSF | 0.0169 |
| TSF | 0.5587 |
| Samenvatting van de resultaten | |||||
| Parameter | Sonde | Naam | Resultaat | CE | SD |
| Dikte | --- | --- | 17.8996 μ | --- | --- |
| Nummer | Disector | neuron | 243833769.1473 | 0.0474 | N / A |
| Volume | Cavalieri Point Grid | volume | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0.0078 | N / A |
| AANBEVELINGEN | |
| Sonde | Object nummer (neuron) |
| CE | 0.0474 |
| Aanbevelingen | CE is aanvaardbaar. |
| Aantal bekeken Disectors te hoog is, verhogen Disector afstand. | |
| Sonde | Regio Volume (volume) |
| CE | 0.0078 |
| Aanbevelingen | CE is aanvaardbaar. |
| AFDELING RESULTATEN | ||
| Sectie | neuron NumObjects neuron NumCorners | volume RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Figuur 2 Resultaten van de Fontal Lobe verkregen met de Stereologer System. Voor de frontale kwab, het langste deel van de stereological proces werd in de systematische bemonstering en snijden. Topografie, het volume en neuronale schatting werden voltooid in ongeveer een dag voor elk vak. De linker hersenhelft was bemonsterd en het aantal is verdubbeld in de tekst te benaderen een schatting voor beide hersenhelften.
Figuur 3 Cortex Neuronale schatting van de bevolking bereikt met BioQuant. BioQuant Het systeem vereist een nauwkeurige topografie voorafgaand aan de cel tellen. Hier een gemiddelde van 13 secties werden bemonsterd. Corticale topografie en de daarop volgende volume schatting vond tussen 15-20 uur voor elk onderwerp. Topografie werd uitgevoerd onder een 2.5x doelstelling en het tellen werd gedaan met behulp van een 100x olie immersie objectief (NA 1.3). Elke honderdste gedeelte werd gekozen door de linker hersenhelft met een gemiddelde van 180 disectors bemonsterd. Zodra de topografie werd voltooid neuronale tellen duurde ongeveer een dag. De linker hersenhelft was bemonsterd en het aantal is verdubbeld in de tekst te benaderen een schatting voor beide hersenhelften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onpartijdige stereology in een primaat hersenen is vergelijkbaar met dat van andere biologische monsters. Echter, gezien de omvang van het primaat hersenen, is een zorgvuldige verwerking van plan aanbevolen, aangezien een enkele halfrond van de vervet aap levert meer dan 1200 delen als gesneden bij 50μm. Eerste adviseren wij stereotaxically het blokkeren van de hersenen in 1 cm blokjes, die een standaard vlak van baanvak tussen blokken en vakken bezit, minimaliseert de gedeeltelijke gedeelten tussen de blokken, en zorgt voor beheersbare grote blokken 5. Een cruciale stap voor de stereology is een systematische bemonstering zodanig is dat 60 tot 10 secties worden verkregen door het referentiegebied. Voor het primaat hersenen, blijft er een aanzienlijke hoeveelheid materiaal onbewerkt, dus met het oog op de mogelijke gegevens van elk brein raden wij bankieren het weefsel in antigeen te behouden voor de lange-termijn onderzoek plannen 6 maximaliseren. Wanneer weefsel dwarshelling, kan een systematische aanpak voor het identificeren van immunodetectie doelwit eiwitten in de aap hersenen worden voorbereid stereology 9. Grotere gebieden, zoals de cortex of de lobben kan eisen 10 tot 14 secties, zodat voorafgaand aan snijden een plan moet worden gedaan om ten minste 10 secties door de kleinste referentie-ruimte van potentieel belang. Een pilot-studie moet ook worden uitgevoerd op een controle onderworpen aan de parameters voor de stereological onderzoek in te stellen. Verder bij de presentatie of interpreteren van gegevens gepubliceerd stereological de asf, TSF, SSF, en Σ Q dienen te worden gemeld samen met de gepaste CE-waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Ikiel Ptito bedanken voor zijn voortdurende technische ondersteuning. NSERC te verlenen aan MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
