Summary
L'organisation anatomique du cerveau des primates peuvent fournir des indications importantes sur les conditions normales et pathologiques chez l'homme. Stéréologie impartiale est une méthode précise et efficace pour l'estimation du nombre de neurones totale (ou autre type cellulaire) dans un espace de référence donnée
Abstract
Le primate non-humain est une espèce importante translationnelle pour comprendre les processus normaux et pathologiques de la fonction du cerveau humain. Stéréologie impartiales, la méthode acceptée que l'état de l'art pour la quantification des objets biologiques dans des coupes de tissus
Protocol
Partie 1: Pré-traitement du tissu doit être fait en fonction de Burke et al. (2009) 5.
- En bref, le tissu doit être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d'autres organes. Dans l'étude actuelle, l'objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu'à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre). Les tissus doivent être bien perfusés avec paraformaldeyhde, glutaraldéhyde, ou du formol. Le cerveau doit être bloquée stéréotaxique, retiré du crâne, pesé, le volume déterminé, cryoprotégés, et surgelés 5.
Partie 2: échantillonnage systématique des tissus, selon Burke et al. (2009) 6.
- Dans cet exemple nous nous sommes concentrés sur le lobe frontal du cerveau vervet. L'espace de référence a été défini pour inclure tissu cortical du sillon central jusqu'au pôle frontal de l'hémisphère gauche. Pour nos buts de la série ont été fixées à 1 / 10 sections dans tout le cortex, sectionné à 50 microns. Une série complète a été colorées avec du violet de crésyl (série # 1). Série 2 a été divisé de telle sorte que la moitié des sections ont été colorées avec du chlorure d'or de la révélation de la myéline et l'autre moitié pour teinté acétylcholine estérase (pour la délimitation de certaines régions sous-corticales). Toutes les autres séries ont été mis en banque dans la préservation d'antigène dans le cadre de nos plans de recherche à long terme.
Partie 3: Stéréologie (pour plus de détails, voir Mouton 2002) 4
- L'estimation totale du nombre de cellules (N) est calculée sur la base de l'équation suivante:
N = -1 x ssf asf -1 x TSF -1 x Σ Q -
Où SSF est la fraction d'échantillonnage article, ASF est la fraction d'échantillonnage région, TSF, si la fraction d'échantillonnage d'épaisseur (l'épaisseur mesurée du tissu est divisée par la hauteur dissecteur), et Σ Q - C'est le nombre total d'objets d'intérêt compté dans le dissecteur. Les prochaines sections de ce protocole montrent comment déterminer la SSF, ASF, DAT et Σ Q. - Fraction d'échantillonnage de section (non informatique)
- L'espace de référence en entier doit être bien défini d'avant en arrière et dorsale à ventrale. Dans cet exemple nous nous sommes intéressés dans le lobe frontal et l'ont définie comme la région de la pointe du pôle frontal (antérieur) à l'sillon central (postérieure) et le sillon latéral (ventrale) et exclus de l'insula.
- Pour le lobe frontal de ce sujet particulier un total de 760 sections ont été collectés systématiquement avec 76 colorées pour violet de crésyl. Depuis la cible était de 10 sections à travers l'espace de référence des sections 1 / 6 violet de crésyl tachés ont été échantillonnés, conduisant à une fraction d'échantillonnage section d'environ 1 / 60. Nous hasard a commencé avec l'un des 6 premiers crésyl violet et les coupes colorées systématiquement échantillonnés sixième par la suite. Un total de 13 sections ont été échantillonnées pour le sujet sélectionné (figure 2).
Fraction de sondage aréolaire (sur ordinateur)- Une étude pilote indique la taille de la grille optimale, la fraction d'échantillonnage de secteur, de goûter à l'espace de référence avec environ 100-300 disectors. Dans le lobe frontal, une taille de grille de 2500 um 2 a donné une moyenne de 254 disectors pour ce sujet (figure 2). La taille de la disector devrait rendement entre environ 0-5 objets comptés, dans ce cas, les neurones.
- Fraction Exemple Epaisseur (sur ordinateur)
- À chaque endroit disector, la hauteur du tissu est mesurée, et une fraction de cette hauteur est échantillonné, ce qui est connu comme la fraction d'échantillonnage de l'épaisseur. Pour déterminer l'épaisseur mesurée, se concentrer dans le plan z jusqu'à ce que la première cellule vient en point, puis légèrement remonté jusqu'à la partie supérieure de la section, c'est à dire jusqu'à ce que le dernier objet apparaît juste hors de discussion. Pour déterminer le fond du tissu, se concentrer dans le plan z jusqu'à ce les cellules sont à peine sortis de discussion.
- Se concentrer dans le plan z, les cellules doivent être colorés à toute profondeur, sinon, cela peut indiquer une pénétration incomplète de la déshydratation tache ou non uniforme du tissu, dans ce cas, les sections doivent être re-colorées. Cette précaution est particulièrement importante pour les tissus immunocolorés qui nécessite la pénétration des immunoprobes à travers des sections de tissu relativement épais. Pour cette raison, les tissus immunocolorés devrait être légèrement de contraste avec une tache de basophiles (par exemple, le violet de crésyl, Hemahématoxyline) afin de déterminer avec précision supérieure et inférieure de la section et de confirmer la pénétration de l'anticorps. Dans cette étude, les sections ont été tranché lors d'une mise en microtome de 50 microns. Après tout traitement de tissu a été complète, l'épaisseur des tissus mesurée en moyenne 17.9μm (figure 2), avec un retrait moyen d'environ 65%. Notez que ces résultats représentent le rétrécissement typique pour les tissus traités pour la préparation histologique de routine 7.
- La hauteur disector par défaut pour l'étude typique est 10 microns. La différence entre la hauteur et l'épaisseur disector section mesurée est la hauteur de garde, le volume du tissu où aucune des caractéristiques biologiques sont comptés. L'utilisation d'une hauteur de garde d'éviter des dommages aux tissus à la surface de sectionnement (par exemple, a perdu bouchons).
- Le nombre total d'objets comptés, Σ Q -
- Pour éviter les biais d'erreurs de reconnaissance, il est impératif que la définition standard est suivie pour la particularité biologique d'intérêt. Dans ce cas, nous étions intéressés à compter neurones. Par conséquent, un neurone a été défini comme ayant un nucléole visible situé au centre et un cytoplasme clairement définis, tandis que les cellules gliales manquaient généralement nucléoles visibles et le cytoplasme. Pour cette réserve 457 neurones ont été comptés.
Partie 4: Stereologer - Un système informatisé Stéréologie (Stéréologie Resource Center, Chester, MD)
- Le système Stereologer invite l'utilisateur à remplir les informations nécessaires de façon étape-par-étape. Dans le champ "Information sur l'étude« la section des paramètres de l'étude sont établies. Depuis un espace de référence doit être défini pour l'étude, le paramètre de volume doit être sélectionné (pour l'espace de référence de l'estimateur Cavalieri doit être sélectionné). Volume de l'objet peut également être sélectionné ici d'estimer le nombre pondéré de volume pour la population des objets d'intérêt. Pour notre exemple, seul le volume de l'espace de référence a été choisie. Pour chaque objet, sélectionnez le nombre et définir la fonction de l'intérêt, dans ce cas, Neurones.
- Initialisation de cas: Dans cette section, l'information sur l'échantillonnage est établie. Entrez l'intervalle d'échantillonnage la dalle (si dalles séparées de tissu ont été tranché de manière exhaustive et chaque section est placée dans un ordre séquentiel puis entrez 1 ici). Entrez le nombre total de sections prises à travers l'espace de référence (dans ce cas 760). Ensuite, entrez l'intervalle d'échantillonnage section (dans ce cas 59). Le système calcule ensuite le nombre de sections à échantillonner (dans ce cas 13).
- Paramètres de la sonde: Cette section définit la grille et la taille disector. Pour le volume, utilisez un faible grossissement 2.5x-10x pour définir l'espacement de grille dans le menu Édition. Grossissement des objets doit être effectué à 100x (NA 1.3 ou 1.4). Zone du cadre est la taille de l'disector, dans ce cas nous avons utilisé l'écran à 50%. La hauteur du cadre est l'épaisseur de la disector; fixé à 10 microns ici. L'écartement des couples est la taille de la grille. Dans notre étude pilote, nous avons trouvé que les rendements entre 2500μm 150-200 cadres espacés de façon systématique uniforme à travers un espace de référence relativement importante. Pour les plus petites régions, une plus petite taille de grille doit être utilisée. Une étude pilote permettra d'identifier les paramètres de la sonde optique pour chaque étude particulière.
- Une fois les paramètres de l'étude ont été établis, l'échantillonnage à travers le tissu peut se poursuivre. Le programme vous invite à déguster la première section. Étape 1: Le programme invite l'utilisateur, sous un faible grossissement, pour tracer l'espace de référence sur la section. Le système va alors placer une grille sur la section sur la base des paramètres de la sonde et l'utilisateur va alors vérifier que les points tombent dans l'espace de référence. Si un point n'est pas dans l'espace de référence, cliquez simplement sur le point et ne seront pas calculés dans le volume. Étape 2: Le système placera une nouvelle grille sur l'espace de référence, basé sur les paramètres d'espacement cadre. Vérifiez que les intersections tombent dans l'espace de référence. Étape 3: Le système va alors demander à l'utilisateur de passer à l'objectif plus fort grossissement et déplacer la scène à la première étape dissecteur 4:. A ce stade, le système invite l'utilisateur à définir le haut et le bas de la section, puis le système définit l'espace d'échantillonnage dans l'axe z Étape 5:. L'utilisateur sera alors de cliquer sur chaque objet qui tombe dans le travers disector le plan z. Les objets qui touchent les lignes rouges ou le bas de la disector ne peuvent pas être comptés. Une fois que chaque objet est compté, cliquez sur suivant. La scène se déplace vers la prochaine et disector étapes 4 et 5 seront répétées. Une fois tous les disectors de la section ont été comptés, le système invite l'utilisateur à insérer le paragraphe suivant séquentielle d'être sondé. Etapes 1-5 sera répété jusqu'à ce que toutes les sections séquentielles ontété échantillonnés. Le système fournira alors les calculs pour les ASF, SSF, TSF, et Σ Q. Basé sur ces paramètres, le système va générer un N estimé, le volume de référence et de CE pour les deux l'estimation du nombre et du volume. Il donnera également des recommandations à devenir plus efficaces ou pour réduire la CE (figure 2).
Partie 5: Résultats du représentant:
Stéréologie Unbiased fournit des estimations fiables et efficaces des populations de cellules au sein d'un espace de référence. Il ya un certain nombre de systèmes informatiques stéréologiques disponibles, qui s'appuient sur un échantillonnage systématique et un espace de référence défini. Nous avons utilisé le système de vie BIOQUANT Sciences pour estimer la population totale des neurones du cortex cérébral de 2 ans à plus de vervets 828 millions (figure 3) avec une moyenne de 0,042 CE. Nous avons ensuite utilisé le système Stereologer à estimer que les comptes du lobe frontal pour environ la moitié du nombre de neurones corticaux 8.
Figure 1 Computer Systems basée Stéréologie. Le set-up de base des systèmes stéréologie est le même, un microscope avec une platine motorisée (XYZ), un contrôleur de scène, caméra vidéo, informatiques et de logiciels. Le système qui est finalement choisie devrait être basée sur l'efficacité, les besoins et l'analyse des coûts.
| Information sur l'étude | |
| Nom de l'étude | Cortex frontal |
| Chercheur principal | MB |
| Espèces | AG |
| Référence espace frontal | Cortex |
| Remarques | |
| INFORMATION DE CAS | |
| Data Collector | MB |
| Date de | Mercredi 30 avril 2008 |
| Groupe | Contrôle |
| Sujet | O26 |
| Remarques | |
| Caractéristiques d'échantillonnage | |
| Intervalle d'échantillonnage Slab | 1 |
| Nombre total d'articles | 760 |
| Intervalle d'échantillonnage section | 59 |
| Section de départ | 2 |
| FRACTIONS | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| SOMMAIRE DES RÉSULTATS | |||||
| Paramètre | Probe | Nom | Résultat | CE | SD |
| Epaisseur | --- | --- | 17.8996 μ | --- | --- |
| Nombre | Disector | neurone | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Volume | Cavalieri point de grille | le volume | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| RECOMMANDATIONS | |
| Probe | Nombre d'objets (neurone) |
| CE | 0,0474 |
| Recommandations | CE est acceptable. |
| Nombre de vues Disectors est trop élevé, augmenter l'espacement Disector. | |
| Probe | Volume Région (en volume) |
| CE | 0,0078 |
| Recommandations | CE est acceptable. |
| RÉSULTATS SECTION | ||
| Section | neurone neurone NumObjects NumCorners | RegPoints volumes |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Figure 2 Résultats du lobe Fontal obtenus avec le système Stereologer. Pour le lobe frontal, la partie la plus longue du processus stéréologiques était dans l'échantillonnage systématique et de sectionnement. Estimer la topographie, le volume et neuronales ont été réalisées en une journée environ pour chaque sujet. L'hémisphère gauche a été échantillonnée et le nombre est doublé dans le texte d'approcher une estimation pour les deux hémisphères.
Figure 3 Estimation Cortex population neuronale Obtenu avec BIOQUANT. Le système nécessite une BIOQUANT topographie exacte avant le comptage des cellules. Voici une moyenne de 13 sections ont été échantillonnés. Topographie corticale et l'estimation du volume subséquente a pris entre 15-20 heures pour chaque sujet. Topographie a été effectuée sous un objectif 2.5x et le comptage a été effectué en utilisant un objectif 100x à immersion (NA 1,3). Chaque section a été choisi 100e partout dans l'hémisphère gauche avec une moyenne de 180 disectors échantillonnés. Une fois que la topographie a été achevé le comptage neuronal a pris environ une journée. L'hémisphère gauche a été échantillonnée et le nombre est doublé dans le texte d'approcher une estimation pour les deux hémisphères.
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Discussion
Stéréologie impartiaux dans un cerveau de primate est similaire à celle des autres échantillons biologiques. Toutefois, étant donné la taille du cerveau des primates, un plan de traitement minutieux est recommandée car un seul hémisphère de l'singe vervet rendements de plus de 1200 sections quand tranché au 50 microns. Premièrement, nous recommandons stéréotaxique bloquant le cerveau en blocs de 1 cm, qui fournit un plan standard de la section entre les blocs et les sujets, minimise coupes partielles entre les blocs, et fournit des blocs de taille gérable 5. Une étape cruciale pour stéréologie échantillonnage systématique est telle que de 60 à 10 sections sont obtenues à travers la zone de référence. Pour le cerveau des primates, ce qui laisse une quantité importante de matières non traitées, ainsi afin de maximiser le potentiel des données obtenues de chaque cerveau, nous suggérons le tissu dans la banque d'antigène de préserver pour les plans de recherche à long terme 6. Lorsque le tissu est incliné, une approche systématique pour identifier immunodétection des protéines cibles dans le cerveau de singe peut être préparé pour stéréologie 9. Agrandir domaines tels que le cortex ou les lobes peut exiger de 10 à 14 sections, donc avant la coupe d'un plan doit être fait pour avoir au moins 10 sections à travers le plus petit espace de référence d'intérêt potentiel. Une étude pilote doit également être réalisé sur un sujet de contrôle pour définir les paramètres de l'étude stéréologiques. Par ailleurs lors de la présentation ou à interpréter les données publiées stéréologiques l'ASF, DAT, SSF, et Σ Q doit être signalé avec les valeurs CE approprié.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu. Subvention du CRSNG au MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
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- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
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- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
