Summary
L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato
Abstract
Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la comprensione dei processi di normale funzione e malattie del cervello umano. Stereologia imparziali, il metodo accettato come state-of-the-art per la quantificazione di oggetti biologici in sezioni di tessuto
Protocol
Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti deve essere fatto secondo Burke et al. (2009) 5.
- In breve, il tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeyhde, gluteraldehyde, o formalina. Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, volume determinato, crioprotetti, e congelati 5.
Parte 2: campionamento sistematico del tessuto, secondo Burke et al. (2009) 6.
- In questo esempio ci siamo concentrati sul lobo frontale del cervello vervet. Lo spazio di riferimento è stato definito per includere tessuto corticale dal solco centrale al polo frontale dell'emisfero sinistro. Per i nostri scopi la serie sono stati fissati a 1 / 10 sezioni in tutta la corteccia, sezionati a 50 micron. Una serie completa era macchiata di violetto cresolo (serie # 1). Serie 2 è stata suddivisa in modo che la metà delle sezioni sono state colorate con cloruro d'oro per la rivelazione della mielina e macchiato altra metà per l'acetilcolina esterasi (per la definizione di talune regioni subcorticali). Tutte le altre serie sono state sopraelevate nel preservare l'antigene come parte dei nostri piani a lungo termine della ricerca.
Parte 3: stereologia (per maggiori dettagli, vedere Mouton 2002) 4
- La stima totale del numero di cellule (N) è calcolato in base alla seguente equazione:
N = -1 x ssf asf -1 x -1 x tsf Σ Q -
Dove SSF è la frazione di campionamento sezione, asf è la frazione di campionamento dell'area, TSF se la frazione di campionamento spessore (dove lo spessore del tessuto misurato viene diviso per l'altezza dissettore) e Σ Q - è il numero totale di oggetti di interesse contati all'interno del dissettore. Le sezioni successive di questo protocollo mostrano come determinare la SSF, asf, TSF e Σ Q. - Sezione Frazione di campionamento (non su computer)
- Lo spazio intero riferimento devono essere ben definiti da anteriore a posteriore e dorsale a ventrale. In questo esempio siamo stati interessati al lobo frontale e lo hanno definito come la regione dalla punta del polo frontale (anteriore) al solco centrale (posteriore) e il solco laterale (ventrale) ed esclusa l'insula.
- Per il lobo frontale di questo particolare argomento per un totale di 760 sezioni sono stati sistematicamente raccolti con 76 colorati per violetto cresolo. Dal momento che l'obiettivo era di 10 sezioni in tutto lo spazio di riferimento sezioni viola 1 / 6 cresile macchiati sono stati campionati, portando ad una frazione sezione campione di circa 1 / 60. Siamo a caso iniziato con una delle prime 6 sezioni cresile colorate viola e sistematicamente a campionamento 1 / 6 dopo. Un totale di 13 sezioni sono stati campionati per il soggetto selezionato (Figura 2).
Area Frazione del campione (computer-based)- Uno studio pilota indicherà la dimensione ottimale della griglia, la Frazione di campionamento Zona, per esempio lo spazio di riferimento con circa 100-300 disectors. All'interno del lobo frontale, una dimensione della griglia di 2500 micron 2 prodotto una media di 254 disectors per questo argomento (Figura 2). Le dimensioni del disector dovrebbe portare tra circa 0-5 oggetti contati, in questo caso, i neuroni.
- Frazione spessore del campione (computer-based)
- In ogni posto disector, l'altezza del tessuto viene misurata, e una frazione di questa altezza viene campionato, questo è noto come la frazione di campionamento spessore. Per determinare lo spessore misurato, messa a fuoco attraverso il piano z fino alla prima cellula viene messa a fuoco, poi di nuovo leggermente la parte superiore della sezione, cioè fino a quando l'ultimo oggetto appare solo fuori fuoco. Per determinare la parte inferiore del tessuto, messa a fuoco attraverso il piano z fino a quando le cellule sono appena fuori fuoco.
- Messa a fuoco attraverso il piano z, le cellule devono essere colorate ad ogni profondità, altrimenti questo può indicare una penetrazione incompleta del disidratazione macchia o non uniforme del tessuto, nel qual caso le sezioni devono essere ri-colorati. Questa precauzione è particolarmente importante per il tessuto immunostained che richiede la penetrazione di immunoprobes attraverso sezioni di tessuto relativamente spesso. Per questo motivo, il tessuto immunostained devono essere leggermente di contrasto con una macchia basofile (ad esempio, violetto cresolo, Hematoxylin) al fine di determinare con precisione superiore e inferiore della sezione e per confermare la penetrazione degli anticorpi. In questo studio le sezioni sono state fette in un ambiente microtomo di 50 micron. Dopo tutto era completo di lavorazione dei tessuti, lo spessore del tessuto misurato una media di 17.9μm (Figura 2), con una contrazione media di circa il 65%. Si noti che questi risultati rappresentano contrazione tipica dei tessuti trattati per la preparazione di routine istologica 7.
- L'altezza disector di default per lo studio tipico è 10μm. La differenza tra l'altezza e lo spessore disector sezione è misurata l'altezza di guardia, il volume del tessuto dove si contano non caratteristiche biologiche. L'uso di un altezza guardia evita danni ai tessuti alle superfici di sezionamento (ad esempio, ha perso caps).
- Il numero totale di oggetti contati, Σ Q -
- Per evitare distorsioni di errori di riconoscimento, è indispensabile che una definizione standard è seguito per la particolare caratteristica di interesse biologico. In questo caso, eravamo interessati a contare i neuroni. Pertanto, un neurone è stato definito come avere un nucleolo visibile in posizione centrale e un citoplasma chiaramente definito, mentre le cellule gliali genere mancava nucleoli visibili e citoplasma. Per questo tema sono stati contati 457 neuroni.
Parte 4: Stereologer - Un sistema computerizzato stereologia (stereologia Resource Center, Chester, MD)
- Il sistema Stereologer richiede all'utente di compilare le informazioni necessarie in un passo-passo della moda. Nella sezione "Informazioni di Studio" sezione dei parametri dello studio sono stabiliti. Dal momento che uno spazio di riferimento deve essere definito per lo studio, il parametro volume dovrebbe essere selezionato (per lo spazio di riferimento lo stimatore Cavalieri dovrebbe essere selezionato). Il volume oggetto può anche essere selezionato qui per stimare il numero ponderata volume per la popolazione di oggetti di interesse. Per il nostro esempio, solo il volume dello spazio di riferimento è stato selezionato. Per ogni oggetto, selezionare il numero e definire la funzione di interesse, in questo caso neuroni.
- Inizializzazione caso: In questa sezione le informazioni di campionamento è stabilito. Inserire l'intervallo lastra di campionamento (se separato lastre di tessuto sono stati affettati tassativamente ed ogni sezione si trova in ordine sequenziale quindi immettere 1 qui). Inserire il numero totale delle sezioni prese attraverso lo spazio di riferimento (in questo caso 760). Quindi, immettere l'intervallo di campionamento sezione (in questo caso 59). Il sistema calcola il numero di sezioni da campionare (in questo caso 13).
- Parametri sonda: Questa sezione definisce la griglia e le dimensioni disector. Per il volume, utilizzare un basso ingrandimento 2,5 x-10x per definire la spaziatura della griglia sotto il menu di modifica. Ingrandimento oggetto deve essere eseguita a 100x (NA 1.3 o 1.4). Zona Frame è la dimensione del disector, in questo caso abbiamo utilizzato il 50% dello schermo. L'altezza del telaio è lo spessore del disector; fissato a 10μm qui. La distanza fra le dimensioni della griglia. Nel nostro studio pilota, abbiamo scoperto che 2500μm rendimenti tra 150-200 fotogrammi distanziati in modo sistematico, uniforme modo attraverso uno spazio di riferimento relativamente grande. Per le aree più piccole, una dimensione della griglia più piccola dovrebbe essere usato. Uno studio pilota di identificare i parametri della sonda ottica per ogni studio particolare.
- Una volta che i parametri di studio sono stati stabiliti, il campionamento attraverso il tessuto può procedere. Il programma chiederà di esempio la prima sezione Fase 1:. Il programma richiede all'utente, in basso ingrandimento, per tracciare lo spazio di riferimento per la sezione. Il sistema sarà poi posto una griglia sopra la sezione in base ai parametri della sonda e l'utente dovrà quindi verificare che i punti cadono all'interno dello spazio di riferimento. Se un punto non è all'interno dello spazio di riferimento è sufficiente fare clic sul punto e non sarà calcolata nel volume. Fase 2: Il sistema posto una nuova griglia nello spazio di riferimento, sulla base di parametri spaziatura telaio. Verificare che le intersezioni cadono all'interno dello spazio di riferimento Fase 3:. Il sistema chiederà all'utente di passare all'obiettivo ingrandimenti e spostare il palco per il dissettore prima Fase 4:. A questo punto il sistema richiede all'utente di definire il superiore e inferiore della sezione allora il sistema imposta lo spazio di campionamento l'asse z Passo 5:. L'utente dovrà quindi fare clic su ogni oggetto che rientra nel disector attraverso il piano z. Gli oggetti che toccano le linee rosse o in fondo alla disector non può essere conteggiato. Una volta che ogni oggetto viene contato, fare clic su Avanti. La tappa si sposta alla prossima disector e passaggi 4 e 5 sarà ripetuto. Una volta che tutti i disectors per la sezione sono stati contati, il sistema chiederà all'utente di inserire la sezione successiva sequenziale per essere sondato. Passi 1-5 si ripeterà fino a quando tutte le sezioni sono sequenzialistato campionato. Il sistema fornirà quindi i calcoli per asf, SSF, TSF, e Σ Q. Sulla base di questi parametri, il sistema genererà una N stimato, il volume di riferimento e CE per entrambi il numero stimato e volume. Si darà anche suggerimenti per diventare più efficienti o per ridurre il marchio CE (Figura 2).
Parte 5: Risultati Rappresentante:
Stereologia Tutti fornisce stime efficiente e affidabile di popolazioni di cellule all'interno di uno spazio di riferimento. Ci sono una serie di sistemi basati su computer stereological disponibili, tutte che si basano su un campionamento sistematico e uno spazio di riferimento definito. Abbiamo usato il sistema BioQuant Life Sciences per stimare la popolazione totale dei neuroni della corteccia cerebrale di 2 anni, cercopitechi a oltre 828 milioni (Figura 3) con una media di 0,042 CE. Abbiamo poi utilizzato il sistema Stereologer di stimare che i conti del lobo frontale per circa la metà del numero di neuroni corticali 8.
Figura 1 Computer sistemi basati stereologia. Il set-up di base dei sistemi stereologia è lo stesso, un microscopio con uno stadio motorizzato (xyz), un controller stadio, videocamera, computer e software. Il sistema che è in definitiva scelta dovrebbe essere basata su efficienza, bisogni e analisi dei costi.
| STUDIO INFORMAZIONI | |
| Nome studio | Corteccia frontale |
| Principal Investigator | MB |
| Specie | AG |
| Spazio di riferimento frontale | Corteccia |
| Note | |
| CASE INFORMAZIONI | |
| Data Collector | MB |
| Data | Mercoledì 30 Aprile, 2008 |
| Gruppo | Controllo |
| Soggetto | O26 |
| Note | |
| CAMPIONAMENTO CARATTERISTICHE | |
| Intervallo di campionamento lastra | 1 |
| Numero totale delle sezioni | 760 |
| Sezione di campionamento Intervallo | 59 |
| Sezione di partenza | 2 |
| FRAZIONI | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| RIEPILOGO RISULTATI | |||||
| Parametro | Sonda | Nome | Risultato | CE | SD |
| Spessore | --- | --- | 17,8996 μ | --- | --- |
| Numero | Disector | neurone | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Volume | Cavalieri Punto Griglia | volume | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| RACCOMANDAZIONI | |
| Sonda | Oggetto Number (neuroni) |
| CE | 0,0474 |
| Raccomandazioni | CE è accettabile. |
| Numero di Visto Disectors è troppo alta, aumentare la spaziatura Disector. | |
| Sonda | Regione Volume (volume) |
| CE | 0,0078 |
| Raccomandazioni | CE è accettabile. |
| SEZIONE RISULTATI | ||
| Sezione | neurone NumObjects NumCorners neurone | il volume RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Figura 2 I risultati del lobo Fontal ottenuti con il sistema Stereologer. Per il lobo frontale, la parte più lunga del processo stereological era nel campionamento sistematico e sezionamento. Stima topografia, il volume e neuronale sono stati completati in circa un giorno per ogni soggetto. L'emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi.
Figura 3 stima della popolazione neuronale Cortex Ottenuto con BioQuant. BioQuant Il sistema richiede una topografia esatta prima del conteggio delle cellule. Qui una media di 13 sezioni sono state campionate. Topografia corticale e la stima del volume successivo ha preso tra le 15-20 ore per ciascun soggetto. Topografia è stato eseguito in un obiettivo 2,5 x e il conteggio è stato fatto con un obiettivo 100x immersione in olio (NA 1.3). Ogni sezione 100 è stato scelto in tutto l'emisfero sinistro con una media di 180 disectors campionati. Una volta la topografia è stato completato il conteggio neuronale ha richiesto circa un giorno. L'emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi.
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Discussion
Stereologia Tutti in un cervello dei primati è simile a quella di altri campioni biologici. Tuttavia, date le dimensioni del cervello dei primati, un piano di trattamento è raccomandato un attento quanto un singolo emisfero della scimmia cercopiteco produce più di 1200 sezioni al taglio a 50 micron. In primo luogo si consiglia stereotaxically bloccare il cervello in blocchi 1 cm, che fornisce un piano standard di sezione tra blocchi e soggetti, minimizza le sezioni parziali tra i blocchi, e fornisce gestibile blocchi di dimensioni 5. Un passo cruciale per stereologia campionamento sistematico è tale che 6-10 sezioni sono ottenute attraverso l'area di riferimento. Per il cervello dei primati, questo lascia una notevole quantità di materiale non trasformato, così al fine di massimizzare il potenziale dei dati ottenuti da ogni cervello si consiglia bancarie del tessuto in antigene preservare a lungo termine piani di ricerca 6. Quando il tessuto è inclinato, immunolocalizzazione un approccio sistematico per identificare proteine bersaglio nel cervello della scimmia può essere preparato per stereologia 9. Grandi aree come la corteccia o dei lobi può richiedere 10-14 sezioni, così prima di sezionare un piano dovrebbe essere fatto per avere almeno 10 sezioni attraverso lo spazio minimo di riferimento di potenziale interesse. Uno studio pilota dovrebbe essere eseguita su un soggetto di controllo per impostare i parametri per lo studio stereological. Inoltre in occasione della presentazione o l'interpretazione dei dati pubblicati stereological il asf, TSF, SSF e Σ Q devono essere riferite in accordo con i valori appropriati CE.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico. NSERC concedere a MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
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- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
