Summary
Анатомической организации мозга приматов может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека. Объективное стереологии это метод точно и эффективно оценки общего количества нейронов (или другого типа клеток) в данной ссылкой пространства
Abstract
Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для понимания нормальных процессов функции и болезни человеческого мозга. Объективное стереологии, метод принят в качестве состоянии-искусство для количественной оценки биологических объектов в срезах тканей
Protocol
Часть 1: Предварительная обработка тканей должно быть сделано в соответствии с Burke и соавт. (2009) 5.
- Короче говоря, ткань должна быть хорошо озарен параформальдегида, глутаральдегида или формалина. Это может быть достигнуто с помощью стандартных transcardial перфузии обычно используется для сбора других органов. В настоящем исследовании тема глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS пока полностью обескровлены. Далее следуют 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр). Ткань должна быть хорошо озарен paraformaldeyhde, gluteraldehyde или формалина. Мозг должен быть stereotaxically заблокированы, удалены из черепа, вес, объем определяется, cryoprotected и замороженные 5.
Часть 2: Систематический отбор проб тканей, в соответствии с Берк и др.. (2009) 6.
- В этом примере мы сосредоточились на лобной доли головного мозга vervet. Ссылки пространство было определено включить корковой ткани от центральной борозды на фронтальной полюс левого полушария. Для наших целей серии были установлены на уровне 1 / 10 секций всей коре, секционные на 50 мкм. Один полный ряд окрашивали крезиловый фиолетовый (серия № 1). Серия 2 была разделена таким образом, что половина из разделов были окрашены золотой хлорида миелина откровения и других окрашенных половину ацетилхолинэстеразы (для разграничения определенных подкорковых областей). Все остальные серии были накренился на антиген сохранить как часть нашей долгосрочных планов исследования.
Часть 3: стереологии (подробнее см. Мутон 2002) 4
- Общая оценка числа клеток (N) рассчитывается на основе следующей формулы:
N = SSF -1 х ASF -1 х TSF -1 х Σ Q -
Где SSF является фракция разделе выборки, ASF есть доля территориальной выборки, TSF, если фракция толщины выборки (где измеряется толщина ткани делят на разборе высота), а Σ Q - это общее количество объектов, представляющих интерес рассчитывали в разборе. В следующих разделах этого протокола показать, как определить, SSF, ASF, TSF и Σ Q. - Раздел выборочная доля (не компьютерные)
- Все пространство ссылка должна быть четко определена спереди назад и от спины к брюху. В этом примере мы были заинтересованы в лобной доле и определили ее как регион от кончика лобного полюса (передний) на центральной борозды (задний) и боковой борозды (вентральной) и исключить изоляцию.
- Для лобной доли этой теме в общей сложности 760 разделов, систематически собранных с 76 окрашивали крезиловый фиолетовый. Так как цель была 10 секций по всему ссылкой пространства 1 / 6 крезиловый фиолетовый окрашенные срезы были отобраны пробы, что приводит к Доля разделе Пример около 1 / 60. Мы случайно начал с одной из первых 6 крезиловый срезах, окрашенных фиолетовый и систематически пробы 1 / 6 в дальнейшем. В общей сложности 13 секций были отобраны для выбранного объекта (рис. 2).
Площадь Пример Дробь (компьютерных)- Пилотное исследование покажет оптимальный размер сетки, доля Площадь отбора проб, к образцу ссылкой пространство около 100-300 disectors. В лобной доли, размер сетки до 2500 мкм 2 дали в среднем 254 disectors по данному направлению (рис. 2). Размер disector должны давать примерно между 0-5 рассчитывал объектов, в данном случае, нейроны.
- Толщина Пример Дробь (компьютерных)
- В каждом месте disector, высота ткани измеряется, и часть этой высоте пробы; это известно как доля выборки толщины. Чтобы определить, измеряется толщина, фокус через плоскость г до первой ячейки приходит в центр внимания, затем вверх слегка верхней части раздела, т. е. до последнего объекта появляется просто не в фокусе. Для определения нижней части ткани, фокус через г-плоскости, пока клетки едва не в фокусе.
- Фокусировка через г-плоскости, камеры должны быть окрашены в любой глубины, а если нет, то это может свидетельствовать о неполном проникновения пятно или неоднородной обезвоживания тканей, и в этом случае разделы должны быть вновь запятнанной. Эта предосторожность особенно важна для immunostained ткани, которая требует проникновения immunoprobes через относительно толстым слоем ткани. По этой причине, immunostained ткани должны быть слегка контрастно с базофильной пятна (например, крезиловый фиолетовый, Хемаtoxylin) для того, чтобы точно определить верхнюю и нижнюю секции, и подтвердить, проникновение антител. В этом исследовании разделы нарезанный на микротома установка 50 мкм. В конце концов ткани обработка была завершена, измеряется толщина ткани усредненные 17.9μm (рис. 2), в среднем сокращение около 65%. Обратите внимание, что эти результаты представляют собой типичные для усадки ткани обработаны для рутинного гистологического подготовки 7.
- По умолчанию высота disector для типичного исследования 10 мкм. Разница между disector высоты и измеряется разделе толщина охранник высота, объем ткани, где не биологическими особенностями, подсчитываются. Использование охранник высота позволяет избежать повреждения тканей при секционированием поверхностей (например, колпачки).
- Общее количество объектов, посчитали, Σ Q -
- Чтобы избежать смещения от признания ошибки, крайне важно, чтобы стандартное определение следуют за конкретной биологической особенностью интереса. В этом случае, мы были заинтересованы в подсчете нейронов. Таким образом, нейрон был определен как имеющий видимых центре города ядрышко и четко определены цитоплазме, а глиальные клетки обычно не хватало видимой ядрышек и цитоплазмы. По этой теме 457 нейронов были подсчитаны.
Часть 4: Stereologer - компьютеризированная система стереологии (стереологии ресурсный центр, Честер, MD)
- Stereologer система предлагает пользователю заполнить необходимую информацию в шаг за шагом моды. В "Исследование информация» параметры исследования установлено. Так как ссылки пространства должны быть определены для исследования, объем параметр должен быть выбран (для опорного пространства оценка Кавальери должен быть выбран). Объект объем также может быть выбран здесь, чтобы оценить количество взвешенного объема для населения объектов, представляющих интерес. Для нашего примера, только объем ссылкой пространства был выбран. Для каждого объекта, выберите номер и определить особенности интерес, в данном случае нейроны.
- Дело инициализации: В этом разделе выборки информации установлено. Введите плиты интервал выборки (если отдельные плиты ткани нарезанный исчерпывающе и каждая секция размещается в последовательном порядке, то введите 1 здесь). Укажите общее количество секций принимаются через ссылку пространство (в данном случае 760). Затем введите интервал разделе выборки (в данном случае 59). Затем система вычисляет количество секций для пробы (в данном случае 13).
- Зонд Параметры: Этот раздел определяет сетку и disector размера. Для объема, использовать малое увеличение 2.5x-10x для определения сетки под меню редактирования. Объект увеличения должна быть выполнена в 100x (NA 1.3 или 1.4). Защищенный грунт является размер disector, в данном случае мы использовали 50% экрана. Высота рамы является толщина disector; установлена на уровне 10 мкм здесь. Кадр интервал размер сетки. В нашем экспериментальном исследовании мы обнаружили, что дает 2500μm между 150-200 кадров расположенных в системно-единообразно через относительно большие ссылкой пространства. Для небольших районов, меньше размер сетки должен быть использован. Пилотное исследование будет определять оптические параметры зонда для каждого конкретного исследования.
- После исследования параметры были установлены, отбор проб через ткань может продолжаться. Программа предложит вам образец первого раздела. Шаг 1: программа предложит пользователю, при небольшом увеличении, проследить ссылкой места на разделе. Система будет место сетки по сечению на основе датчика параметров и пользователь будет затем проверить, что точки ложатся в ссылку пространства. Если дело не в ссылку пространства просто нажмите на точку и не включаются в объем. Шаг 2: Система место новую сетку над ссылкой пространства, основанного на параметры кадра интервал. Убедитесь, что пересечение подпадают ссылкой пространство. Шаг 3: система будет предлагать пользователю перейти к более высоким увеличением цель и двигаться к стадии первого прозектора Шаг 4. На этом этапе система предложит пользователю определить Верхняя и нижняя секции, то система устанавливает выборочного пространства в оси Z. Шаг 5:. Пользователь будет нажать на каждый объект, который входит в disector через г-плоскости. Объекты, которые касаются красных линий или нижней части disector не могут быть подсчитаны. После каждого объекта учитывается, нажмите кнопку Далее. Этапе перехода к следующему disector и шаги 4 и 5 будут повторяться. Как только все disectors для раздела были пересчитаны, система предложит пользователю вставить следующий последовательный раздел прощупываться. Шаги 1-5 будут повторяться, пока все последовательные разделыБыли исследованы пробы. Система будет обеспечивать расчеты для ASF, SSF, TSF, и Σ Q. Исходя из этих параметров, система будет генерировать оценкам N, ссылки объем и СЕ для обеих предполагаемое количество и объем. Это также даст рекомендации, чтобы стать более эффективным и сократить CE (рис. 2).
Часть 5: Представитель Результаты:
Объективное стереологии обеспечивает эффективную и надежную оценку клеточных популяций в ссылку пространства. Есть целый ряд компьютерных систем, доступных стереологического, все из которых зависят от систематического отбора проб и определены ссылкой пространства. Мы использовали BioQuant Life Sciences системы для оценки общей популяции нейронов коры головного мозга на 2-летний vervets быть более 828 миллионов (рис. 3) со средним СЕ 0,042. Мы были впоследствии использованы Stereologer системы для оценки, что лобная доля приходится около половины числа нейронов коры 8.
Рисунок 1 Компьютерные стереологии Systems. Основную настройку системы стереологии то же самое, микроскоп с моторизованными этапе (XYZ), этап контроллер, видеокамеру, компьютер и программное обеспечение. Системы, которая в конечном итоге выбрали должны быть основаны на эффективность, потребности, и анализ затрат.
| ИССЛЕДОВАНИЕ ИНФОРМАЦИЯ | |
| Исследование Имя | Лобной коре |
| Главный исследователь | МБ |
| Вид | А. Г. |
| Ссылка космического Фронтальная | Кора |
| Примечания | |
| Случае информация | |
| Сборщика данных | МБ |
| Дата | Среда, 30 Апреля 2008 |
| Группа | Контроль |
| Тема | O26 |
| Примечания | |
| ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫБОРКИ | |
| Плита Интервал дискретизации | 1 |
| Общее количество разделов | 760 |
| Интервал выборки Раздел | 59 |
| Начиная раздел | 2 |
| ФРАКЦИЙ | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| РЕЗУЛЬТАТЫ РЕЗЮМЕ | |||||
| Параметр | Зонд | Имя | Результат | CE | SD |
| Толщина | --- | --- | 17,8996 μ | --- | --- |
| Номер | Disector | нейрон | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Объем | Кавальери узлах регулярной сетки | объем | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| РЕКОМЕНДАЦИИ | |
| Зонд | Объект номер (нейрон) |
| CE | 0,0474 |
| Рекомендации | CE является приемлемым. |
| Количество просмотров Disectors слишком высока, увеличение Disector интервал. | |
| Зонд | Регион объем (объем) |
| CE | 0,0078 |
| Рекомендации | CE является приемлемым. |
| Раздел РЕЗУЛЬТАТЫ | ||
| Раздел | нейрона NumObjects нейрона NumCorners | Объем RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Рисунок 2 Результаты Fontal Мочка Полученные с Stereologer системы. Для лобной доли, длинная часть стереологического процесса в систематический отбор проб и секционирования. Топография, объем и нейронных оценки были завершены примерно в день для каждого предмета. Левое полушарие было проб и их число удвоилось в тексте приблизительным оценкам для обоих полушарий.
Рисунок 3 Cortex нейронов Оценка численности населения Полученные с BioQuant. BioQuant система требует точной топографии до подсчета клеток. Здесь в среднем на 13 разделов были отобраны. Корковая топографии и последующей оценки объема потребовалось от 15-20 часов по каждому предмету. Топография проводился в 2,5 раза объективных и подсчете было сделано с использованием 100x цель иммерсионного масла (NA 1.3). Каждая сотая секция была выбрана по всему левого полушария в среднем 180 disectors выборку. После топография была завершена нейронов подсчет ушло около суток. Левое полушарие было проб и их число удвоилось в тексте приблизительным оценкам для обоих полушарий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Объективное стереологии в приматов мозг похож на другие биологические образцы. Однако, учитывая размер мозга приматов, тщательный план обработки рекомендуется, так как одно полушарие vervet обезьяна дает более 1200 разделов, когда нарезанный на 50 мкм. Сначала мы рекомендуем stereotaxically блокирование мозга в 1 см блоков, которая обеспечивает стандартные плоскости раздела между блоками и предметов, сводит к минимуму частичного раздела между блоками, а также предоставляет управляемые блоки размером 5. Важным шагом для стереологии является систематической выборки, что 6-10 разделов получены через ссылку области. Для мозга приматов, это оставляет значительное количество материала, необработанные, поэтому для того, чтобы максимально использовать потенциал данных, полученных от каждого мозга, мы предлагаем банковские ткани антигена сохранить для долгосрочных планах научно-исследовательских 6. Когда ткань вираж, системный подход иммунодетекции для идентификации белков-мишеней в мозг обезьяны могут быть подготовлены для стереологии 9. Большие площади таких как кора или долей может потребоваться 10-14 разделов, поэтому перед секционирования план должен быть по крайней мере 10 секций по наименьшей ссылкой пространство потенциальный интерес. Пилотное исследование также должно быть выполнено на контроль вопрос задать параметры для стереологического исследования. Кроме того, при представлении или интерпретации опубликованных данных стереологического ASF, TSF, SSF, и Σ Q должны быть представлены вместе с соответствующими значениями CE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Ikiel Ptito за его постоянную техническую поддержку. NSERC предоставлять депутат.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
