Veta vad som räknas: Unbiased Stereology i den icke-mänskliga primater Brain

Summary

Den anatomiska organisation primater hjärnan kan ge viktiga insikter i normala och patologiska tillstånd hos människor. Objektiva stereology är en metod för korrekt och effektivt beräkna det totala neuron nummer (eller annan celltyp) i en given referens utrymme

Abstract

De icke-mänskliga primater är en viktig translationella arter för att förstå den normala funktionen och sjukdomsprocesser i den mänskliga hjärnan. Objektiva stereology, metoden accepteras som state-of-the-art för kvantifiering av biologiska objekt i vävnadssnitt

Protocol

Del 1: förbehandling av vävnaden bör göras enligt Burke et al. (2009) ^5.

1. Kortfattat bör vävnads vara väl perfusion med paraformaldehyd, glutaraldehyd eller formalin. Detta kan uppnås genom vanliga transcardial perfusion vanligtvis används för att skörda andra organ. I den aktuella studien i ämnet var djupt sederad med ketamin hydroklorid (10 mg / kg im), avlivas med en överdos av natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) och perfusion transcardially med 0,1 M PBS tills det är helt exsanguinated. Detta följs av en 4% paraformaldehyd lösning i PBS i 5 min (~ 1 liter). Vävnad skall vara väl perfusion med paraformaldeyhde, gluteraldehyde eller formalin. Hjärnan bör vara stereotaxically blockeras avlägsnats från skallen, vägde, volym bestäms cryoprotected, och fryst ^5.

Del 2: Systematisk provtagning av vävnad, enligt Burke et al. (2009) ^6.

1. I detta exempel har vi fokuserat på frontalloben i vervet hjärnan. Hänvisningen utrymme definierades att omfatta kortikal vävnad från centrala sulcus till den främre stolpen i vänster hjärnhalva. För våra syften serien sattes till 1 / 10 sektioner i hela cortex, uppställd på 50μm. En komplett serie var fläckad med Cresyl violett (serie # 1). Serie 2 delades så att hälften av avsnitten var färgade med guld klorid för myelin uppenbarelse och den andra hälften färgas för acetylkolin esteras (för avgränsning av vissa subkortikala områden). Alla andra serier har bankas i antigen bevara som en del i vår långsiktiga forskningsplaner.

Del 3: Stereology (för mer information, se Mouton 2002) ⁴

1. Den totala uppskattningen av cell nummer (N) beräknas utifrån följande ekvation:
   N = SSF -1 x asf -1 x TSF -1 x Σ Q -
   När SSF är den del provtagning fraktionen är ASF området provtagning fraktionen TSF om tjockleken provtagning fraktion (där de uppmätta tjockleken av vävnaden divideras med DISSEKTOR höjd), och Σ Q - är det totala antalet objekt räknade intresse inom DISSEKTOR. I nästa avsnitt i detta protokoll visar hur man bestämmer SSF, ASF, TSF och Σ Q.
   
2. § Provtagning Fraktion (icke-datorbaserat)
   1. Hela referens utrymmet måste vara väl definierade från främre till bakre och rygg till ventrala. I detta exempel var vi intresserade av pannloben och har definierat det som regionen från spetsen på främre stolpen (främre) till den centrala sulcus (bakre) och den laterala sulcus (ventrala) och uteslöt isolering.
   2. För frontalloben i detta speciella ämne totalt 760 sektioner har systematiskt samlats in med 76 färgas för Cresyl violett. Eftersom målet var 10 sektioner under referensperioden plats 1 / 6 Cresyl violett färgade snitt ingick i stickprovet, vilket ledde till ett avsnitt Exempel Fraktion av ca 1 / 60. Vi började slumpmässigt med en av de första 6 Cresyl sektioner violett färgade och provtas systematiskt 1 / 6 därefter. Sammanlagt 13 avsnitt ingick i urvalet för det valda ämnet (Figur 2).
3. 
   Area Exempel Fraktion (datorbaserat)
   
   1. En pilotstudie kommer att visa den optimala nätet storlek, området Provtagning Bråk, till exempel referensen utrymmet med ca 100-300 disectors. Inom pannloben, gav ett rutnät storlek på 2500 ìm ² i genomsnitt 254 disectors för detta ämne (figur 2). Storleken på disector ska ge mellan ca 0-5 räknas objekt, i detta fall, nervceller.
4. Tjocklek Exempel Fraktion (datorbaserat)
   1. Vid varje disector plats är höjden av vävnad mäts, och en bråkdel av denna höjd är provtas, detta kallas Tjocklek Provtagning Bråk. För att bestämma den uppmätta tjockleken, fokus genom z-planet tills den första cellen kommer i fokus, sedan tillbaka något till toppen av avsnittet, dvs tills det sista objektet visas bara ur fokus. För att bestämma botten av vävnad, fokus genom z-planet tills cellerna är knappt ur fokus.
   2. Fokusering genom z-planet, bör cellerna färgas vid varje djup, om inte, kan detta indikera en ofullständig penetration av fläcken eller icke-enhetlig uttorkning av vävnad, i vilket fall de avsnitt bör åter färgas. Denna försiktighetsåtgärd är särskilt viktigt för immunostained vävnad som kräver penetration av immunoprobes genom relativt tjocka vävnadssnitt. Av denna anledning bör immunostained vävnad lätt counterstained med basofila bets (t.ex. Cresyl violett, Hematoxylin) för att exakt fastställa toppen och botten av avsnittet och bekräfta penetration av antikroppen. I denna studie avsnitten var skivade på en mikrotom inställning av 50μm. Efter alla vävnadsbehandling var fullständig, i genomsnitt uppmätt vävnadstjocklek 17.9μm (figur 2), med en genomsnittlig krympning på ca 65%. Observera att dessa resultat representerar typiska krympning för vävnad som behandlats för rutinmässig histologisk förberedelse ^7.
   3. Standardinställningen disector höjd för den typiska studien är 10μm. Skillnaden mellan disector höjd och den uppmätta sektionen tjocklek är vakten höjden, volymen av vävnaden där inga biologiska funktioner räknas. Användningen av en vakt höjd förhindrar vävnadsskada vid sektionering ytor (t.ex., förlorade Caps).
5. Det totala antalet objekt som räknas, Σ Q -
   1. För att undvika bias från igenkänningsfel är det absolut nödvändigt att en standard definition följas för de särskilda biologiska funktionen av intresse. I detta fall var vi intresserade av att räkna nervceller. Därför var en neuron anses ha ett synligt centralt beläget kärnsystemet och en tydligt definierad cytoplasma, medan gliaceller i allmänhet saknat synliga nukleolerna och cytoplasman. För detta ämne 457 nervceller räknades.

Del 4: Stereologer - ett datoriserat Stereology System (Stereology Resource Center, Chester, MD)

1. Den Stereologer System uppmanar användaren att fylla i nödvändig information i en steg-för-steg sätt. I "Studie information" parametrarna av studien är etablerade. Eftersom en hänvisning utrymme måste definieras för studien bör volymen parameter väljas (för referens utrymme Cavalieri estimatorn bör väljas). Objekt volym kan också väljas här för att uppskatta antalet viktade volym för befolkningen i objekt av intresse. I vårt exempel var bara volymen av hänvisningen utrymme valt. För varje objekt, markerar du numret och definiera funktionen av intresse, i detta fall nervceller.
2. Mål Initiering: I detta avsnitt provtagningen informationen är etablerad. Skriv in plattan samplingsintervallet (om separata plattor av vävnad var skivad uttömmande och varje avsnitt placeras i ordningsföljd ange ett här). Ange det totala antal sektioner tas genom referensen rymden (i detta fall 760). Ange sedan intervallet avsnittet provtagningen (i detta fall 59). Systemet beräknar sedan antalet sektioner som ska provtas (i detta fall 13).
3. Probe Parametrar: Detta avsnitt definierar nätet och disector storlek. För volym, använd en låg förstoring 2,5 x-10x att definiera rutnätet under Redigera-menyn. Objekt förstoringen bör utföras 100x (NA 1,3 eller 1,4). Frame området är storleken på disector, i detta fall använde vi 50% skärm. Ramen höjd är tjockleken på disector, inställd på 10μm här. Spantavståndet är storleken på nätet. I vår pilotstudie fann vi att 2500μm ger mellan 150-200 bilder fördelade på ett systematiskt, enhetligt sätt genom ett relativt stort referens utrymme. För mindre områden bör en mindre storlek på rutnät användas. En pilotstudie kommer att identifiera den optiska givaren parametrarna för varje enskild studie.
4. När studien parametrar som har fastställts, får provtagning genom vävnaden fortsätta. Programmet kommer att uppmana dig att prova det första avsnittet Steg 1:. Programmet kommer att fråga användaren, under låg förstoring, spåra hänvisningen utrymme på sträckan. Systemet kommer då att placera ett rutnät över avsnittet bygger på sonden parametrar och användaren kommer då att kontrollera att punkterna faller inom referensområdet utrymme. Om en punkt ligger inte inom referens utrymme klickar du bara på punkt och räknas inte in i volym. Steg 2: Systemet kommer att placera ett nytt galler under referensperioden utrymme, baserat på spantavståndet parametrar. Kontrollera att korsningarna faller inom referensområdet utrymme. Steg 3: Systemet kommer då att uppmana användaren att byta till den högre förstoringen mål och flytta scenen till den första DISSEKTOR Steg 4:. Vid denna punkt systemet uppmanar användaren att definiera toppen och botten av sektionen sedan systemet sätter provtagning utrymme i z-axeln. Steg 5: Användaren kommer då klicka på varje objekt som faller inom disector genom z-planet. Objekt som rör de röda linjerna eller botten av disector kanske inte räknas. När varje objekt räknas, klicka på Nästa. Scenen kommer att flytta till nästa disector och steg 4 och 5 kommer att upprepas. När alla disectors för sektionen har räknats, kommer systemet att uppmana användaren att sätta in nästa sekventiella avsnitt för att bli utforskad. Steg 1-5 kommer att upprepas tills alla sekventiella sektioner harhar provtagits. Systemet kommer sedan ge beräkningarna för asf, SSF, TSF och Σ Q. Baserat på dessa parametrar, kommer systemet att generera uppskattningsvis N, referens volym och CE: s för både det uppskattade antalet och volym. Det kommer också att ge rekommendationer för att bli effektivare eller minska CE (figur 2).

Del 5: representativa resultat:

Objektiva stereology ger effektiva och tillförlitliga uppskattningar av cellpopulationer inom en referens utrymme. Det finns ett antal av datorbaserade stereological system tillgängliga, som alla förlitar sig på systematisk insamling och en definierad plats. Vi har använt BioQuant Life Sciences system för att uppskatta den totala neuronala befolkningen i hjärnbarken av 2-åriga vervets vara över 828 miljoner (Figur 3) med en genomsnittlig EG av 0,042. Vi har därefter använt Stereologer systemet att uppskatta att pannloben svarar för ungefär hälften av kortikala neuroner ^8.

Figur 1 Datorbaserad Stereology Systems. Den grundläggande uppsättning av stereology systemen är densamma, ett mikroskop med en motordriven stadium (xyz), en scen styrenhet, videokamera, dator och programvara. Det system som slutligen väljs bör baseras på effektivitet, behov och kostnadsanalys.

Studieinformation
Studie Namn	Frontala cortex
Principal Investigator	MB
Arter	AG
Referens Space Frontal	Cortex
Anteckningar
CASE INFORMATION
Data Collector	MB
Datum	Onsdag 30 april, 2008
Grupp	Kontroll
Ämne	O26
Anteckningar
PROVTAGNING EGENSKAPER
Slab samplingsintervall	1
Totalt antal sektioner	760
§ samplingsintervall	59
Starta §	2
FRAKTIONER
ASF	0,0002
SlabSF	1,0000
SSF	0,0169
TSF	0,5587

Sammanfattning av resultaten
Parameter	Probe	Namn	Resultat	CE	SD
Tjocklek	---	---	17,8996 μ	---	---
Antal	Disector	neuron	243833769.1473	0,0474	N / A
Volym	Cavalieri Point Grid	volym	1719769397954.1284 μ ^ 3	0,0078	N / A

REKOMMENDATIONER
Probe	Objekt Nummer (neuron)
CE	0,0474
Rekommendationer	CE är acceptabelt.
Antal Sett Disectors är för hög, Öka Disector avstånd.
Probe	Region Volume (volym)
CE	0,0078
Rekommendationer	CE är acceptabelt.

Avsnitt leder
§	neuron NumObjects neuron NumCorners	volym RegPoints
1. 40	48	34
2. 26	52	44
3. 29	56	48
4. 39	100	83
5. 49	112	83
6. 53	156	120
7. 65	128	106
8. 45	108	100
9. 52	100	77
10. 26	64	60
11. 21	44	44
12. 11	36	32
13. 1	12	6

Figur 2 Resultat från Fontal Lobe fås med Stereologer systemet. För pannloben, var den längsta delen av stereological processen i systematisk provtagning och snittning. Topografi, volym och neuronala uppskattning avslutades i ungefär en dag för varje ämne. Den vänstra hjärnhalvan var provtagning och antalet fördubblas i texten till ungefärlig uppskattning för båda hjärnhalvorna.

Figur 3 Cortex Neuronal populationsberäkning erhålls med BioQuant. Den BioQuant Systemet kräver en exakt topografi innan cellen räkna. Här i genomsnitt 13 avsnitten ingick i urvalet. Kortikala topografi och efterföljande volymer uppskattning tog mellan 15-20 timmar för varje ämne. Topografi utfördes under en 2.5x mål och räkna gjordes med hjälp av en 100x mål oljeimmersion (NA 1,3). Varje 100:e avsnitt valdes hela vänster hjärnhalva med ett genomsnitt på 180 provtas disectors. När topografi avslutades neuronala räkna tog ungefär ett dygn. Den vänstra hjärnhalvan var provtagning och antalet fördubblas i texten till ungefärlig uppskattning för båda hjärnhalvorna.

Discussion

Objektiva stereology i en primat hjärna är liknande till det av andra biologiska prover. Med tanke på storleken på primat hjärnan, är en noggrann bearbetning av planen rekommenderas eftersom en enda halvklot av grön markatta ger mer än 1200 delarna när skivad på 50μm. Först rekommenderar vi stereotaxically blockerar hjärnan i 1 cm block, som ger en standard plan sträckan mellan block och ämnen, minimerar partiella sträckorna mellan blocken, och ger hanterbar storlek block ^5. Ett avgörande steg för stereology är systematisk provtagning sådan att 6-10 § erhålls genom referenspunkten området. För primat hjärnan, ger detta en betydande mängd material obearbetade, så för att maximera potentialen data från varje hjärna föreslår vi bank vävnaden i antigen bevara för långsiktiga forskningsplaner ^6. När vävnaden är bankas, kan en systematisk immunodetection metod för att identifiera målproteiner hos apa hjärnan vara beredd på stereology ^9. Större områden som hjärnbarken eller lober kan kräva 10 till 14 avsnitt, så innan snittning en plan bör göras för att ha minst 10 delar genom den minsta referens loppet av potentiellt intresse. En förstudie ska också utföras på en kontroll under förutsättning att ställa in parametrarna för stereological studien. Dessutom när den lägger fram eller tolka publicerade stereological data ASF, TSF, SSF, och Σ Q ska redovisas tillsammans med motsvarande CE-värden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereologer	Stereology Resource Center (Chester, MD)	www.disector.com
Stereology Tool-Kit Stereologer system	BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)
StereoInvestigator	MBF Bioscience