Summary
Primat beynin anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler sağlayabilir. Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkin bir biçimde, belirli bir referans alanı toplam nöron numarası (veya başka bir hücre tipi) tahmin etmek için bir yöntemdir
Abstract
Insan dışı primat normal insan beyninin fonksiyonu ve hastalık süreçleri anlamak için önemli bir translasyonel türüdür. Hakkında tarafsız stereology, doku bölümlerde biyolojik nesnelerin ölçümü için state-of-the-art olarak kabul edilen yöntem
Protocol
Bölüm 1: Ön-işleme doku Burke ve ark göre yapılmalıdır. (2009) 5
- Kısaca, doku paraformaldehid, glutaraldehid, ya da formalin ile perfüze olması gerekir. Bu, genellikle diğer organlarda hasat için kullanılan standart transcardial perfüzyon yoluyla elde edilebilir. Bu çalışmada bu konuda derin sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv), aşırı dozda ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im), sedasyon ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze. Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir. Doku paraformaldeyhde, gluteraldehid, ya da formalin ile perfüze edilmelidir. Beyin stereotaxically bloke kafatası çıkarıldı, tartılır olmalıdır, hacmi belirlenir, cryoprotected ve 5 donmuş.
Bölüm 2: doku Sistematik Örnekleme, Burke ve ark. (2009) 6.
- Bu örnekte vervet beynin frontal lob üzerinde duruldu. Referans alan, merkez sulkus sol hemisfer ön direğe kortikal doku içerecek şekilde tanımlanmıştır. Bizim amaçlarımız için seri 50μm az kesitli korteks boyunca 1 / 10 bölümleri kuruldu. Bir tam serisi cresyl menekşe (seri # 1) ile boyandı. Seri 2 bölümden yarısı altın klorür miyelin vahiy ve asetilkolin esteraz için diğer yarısı boyanmış (belirli subkortikal alanları tarif) ile boyandı, böylece ayrıldı. Tüm diğer serileri, bizim uzun vadeli araştırma planlarının parçası olarak antijen muhafaza banked edildi.
Bölüm 3: Stereology (ayrıntılı bilgi için bakınız, Mouton 2002) 4
- Hücre sayıları toplam tahmini (N) aşağıdaki denklemle hesaplanır:
N = ssf -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q -
Sayılır ilgi nesnelerin toplam sayısı kalınlık örnekleme fraksiyonu (doku ölçülen kalınlığı disektör yüksekliği bölünmüş olduğu), ve Σ Q ssf bölümde örnekleme fraksiyonu, ASF alanında örnekleme fraksiyonu, tsf. disektör içinde. Bu protokolün sonraki bölüm ssf, asf, tsf ve Σ S nasıl belirleneceği göstermektedir. - Bölüm Örnekleme Kesir (bilgisayar tabanlı)
- Tüm referans alan, ventral posterior ve dorsal anterior tanımlanmış olmalıdır. Bu örnekte, frontal lob ilgilenmişlerdir ve merkezi sulkus (posterior) ve lateral sulcus (ventral), frontal kutup (ön) ucundan bölge olarak tanımlanmış ve insula hariç.
- Frontal lob bu konu için toplam 760 bölümden sistematik cresyl menekşe 76 boyandı toplanmıştır. Hedef referans alan boyunca 10 bölüm olduğu için 1 / 6 cresyl mor boyanan kesitler 1 / 60 ile ilgili bir bölüm Örnek Kesir önde gelen örneklenerek elde edilmiştir. Biz rastgele bir ilk 6 cresyl mor boyanan kesitler ile başlayan ve sistematik olarak bundan sonra 1 / 6 örneklenmiş. Seçilen konu (Şekil 2) toplam 13 bölümden örneklendi.
Alan Örnek Kesir (bilgisayar tabanlı)- Bir pilot çalışma, yaklaşık 100-300 disectors referans alan örnek, optimum ızgara boyutu, Alan Örnekleme Kesir gösterecektir. Frontal lob içinde, 2500 mm 2 ızgara boyutu 254 disectors (Şekil 2) bu konu için ortalama vermiştir. Bu durumda 0-5 sayılır nesneleri, nöronlar hakkında disektör boyutu arasında boyun eğmek zorundadır.
- Kalınlığı Örnek Kesir (bilgisayar tabanlı)
- Her disektör yerde, doku yüksekliği ölçülür ve bu yükseklikte bir kısmını örneklenir, bu kalınlık örnekleme fraksiyonu olarak bilinir. Ölçülen kalınlığını belirlemek için, ilk hücrenin, son nesne, odak sadece görünene kadar yedekleme bölümüne, yani üst biraz sonra, odak noktası haline gelene kadar z-düzlemi ile odak. Hücrelerin zar zor dışarı odak kadar dokusunun alt belirlemek için, z-düzlemi ile odaklanır.
- Z-düzlemi ile yoğunlaşırken, hücreler her derinlikte boyanmış olmalıdır; yoksa, bu bölümleri yeniden boyanmış olmalıdır, bu durumda, doku, leke ya da düzgün olmayan dehidratasyon tamamlanmamış bir penetrasyon gösterebilir. Bu önlem, nispeten kalın bir doku bölümleri ile immunoprobes penetrasyonu gerektirir ile immunohistokimyasal doku için özellikle önemlidir. Bu nedenle, immunohistokimyasal boyanan doku hafifçe bazofilik bir leke (örneğin, cresyl menekşe, hema zıt olmalıdırtoxylin) bölümün üst ve alt sırasına göre doğru belirlemek ve antikor penetrasyon onaylamak için. Bu çalışmada bölümleri 50μm bir mikrotom ayarda dilimlenmiş. Tüm doku işlemleri tamamlandıktan sonra, ölçülen doku kalınlığı, yaklaşık% 65 ortalama daralma ile, 17.9μm (Şekil 2) ortalama. Bu sonuçlar, rutin histolojik hazırlık 7 için işlenmiş doku için tipik büzülme temsil ettiğini unutmayın .
- Tipik bir çalışma için varsayılan disektör yüksekliği 10μm. Disektör yüksekliği ve ölçülen kesit kalınlığı arasındaki fark, koruma yüksekliği, biyolojik özellikleri yok sayılır doku hacmi. Bir bekçi yüksekliği kullanımı (örneğin, kaybolan kapakları) kesit yüzeyleri, doku hasarı önler.
- Nesnelerin toplam sayısı, Σ Q -
- Önyargı tanıma hataları önlemek için, standart bir tanım ilgi özellikle biyolojik özelliği olduğunu zorunludur. Bu durumda, biz nöronlar sayma ilgilenmişlerdir. Bu nedenle, bir nöron, glial hücreleri genellikle görünür nükleol ve sitoplazma yoksun ise, görünür bir merkezi bir konuma nükleolus ve açıkça tanımlanmış sitoplazma olarak tanımlandı. Bu konu 457 nöronlar sayıldı.
Bölüm 4: Stereologer - Bilgisayarlı Stereology Sistemi (Stereology Kaynak Merkezi, Chester, MD)
- Stereologer Sistemi kullanıcı bir adım-adım moda, gerekli bilgileri doldurmak ister . "Çalışma Bilgileri" bölümünde çalışmanın parametreleri oluşturulmuştur. Bir referans alan çalışma için tanımlanmış olmalıdır, ses parametre (referans alanı Cavalieri tahmincisi seçili olmalıdır) seçili olmalıdır. Nesne hacmi de ilgi nesnelerin nüfus sayısı ağırlıklı hacmini tahmin etmek için seçilmiş olabilir. Örneğin, sadece referans alan hacmi seçildi. Her nesne için, numarayı seçin ve bu durumda Nöronlar, faiz özelliğini tanımlamak.
- Vaka Başlatma: Bu bölümde örnekleme bilgi kurulmuştur. Slab örnekleme aralığı (doku ayrı plaka ince ayrıntısına kadar dilimlenmiş ve her bölümde sırayla yerleştirilir, daha sonra burada 1 girin) girin. Referans alan (bu durumda 760) üzerinden alınan bölümlerin toplam sayısını girin. Sonra bölümde örnekleme aralığı (Bu durumda 59) girin. Sistem daha sonra numune alınacak (bu durumda 13) bölümlerinin sayısını hesaplar.
- Probe Parametreler: Bu bölümde, ızgara ve disektör boyutunu tanımlar. Hacmi için düzenleme menüsü altında, ızgara aralığı tanımlamak için 2.5x-10x düşük bir büyütme kullanabilirsiniz. Nesne büyütme 100x (NA 1.3 veya 1.4) yapılmalıdır. Çerçeve alanı, disektör boyutunu Bu durumda biz% 50 Ekran kullandı. Çerçeve yüksekliği disektör kalınlığı; burada 10μm olarak belirlenmiştir. Çerçeve aralığı, ızgara boyutu. Pilot çalışmada 150-200 kare arasında 2500μm verim göreceli olarak büyük bir referans alanı üzerinden sistematik bir düzgün bir şekilde yerleştirilen bulundu. Daha küçük alanlar için, küçük bir ızgara boyutu kullanılmalıdır. Bir pilot çalışma, her bir çalışma için optik prob parametreleri belirleyecektir.
- Çalışma parametreleri kurulmuş olup, örnekleme yoluyla doku geçebilirsiniz. Programı ilk bölümünde örnek isteyecektir Adım 1: program bölümünde referans uzayı izlemek için düşük büyütme altında, kullanıcı isteyecektir. Sistem daha sonra daha sonra bu noktaları referans alanı içinde kalan doğrular prob parametreleri ve kullanıcı dayalı bölümü üzerinde bir tablo koyacaktır. Bir nokta referans alanı içinde değilse sadece noktaya tıklayın ve hacmin içine hesaplanır olmayacaktır Adım 2: sistemi çerçevesinde aralığı parametreleri dayalı referans alan üzerine yeni bir ızgara koyacaktır. Doğrulayın kavşakları referans alanı içinde yer almaktadır Adım 3: Ardından sistem, kullanıcının yüksek büyütme amacı geçmek ve ilk disektör üzere sahneye taşımak isteyecektir Adım 4: Bu noktada sistemin kullanıcı tanımlamak için ister bölümün üst ve alt sisteminin z ekseni Adım 5 örnekleme alanı ayarlar: Kullanıcı daha sonra z-düzlemi ile disektör içinde düşen her nesne üzerine tıklayın. Kırmızı çizgiler veya disektör alt dokunmatik Nesneler sayılmayacaktır. Her nesne sayılır sonra, bir sonraki tıklatın. Aşama bir sonraki disektör ve 4 ve 5 tekrarlanacaktır adımları hareket edecektir. Disectors bölüm için tüm sistem bir sonraki probed sıralı bölümü eklemek için kullanıcı istemi, sayılmıştır. Sıralı tüm bölümleri kadar 1-5 adımlarını tekrar olacakörneklenmiş oldu. Sistem daha sonra, asf, ssf, tsf ve Σ Q hesaplamaları sağlayacaktır . Bu parametreler göre, sistemi, referans hacmi tahmini K oluşturmak ve CE tahmini sayısı ve hacim olacak. Aynı zamanda daha verimli hale öneriler verecektir ya da azaltmak için CE (Şekil 2).
Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:
Hakkında tarafsız stereology bir referans alanı içinde hücre popülasyonlarının verimli ve güvenilir tahminler sağlar. Her biri sistematik örnekleme ve tanımlanmış bir referans alanı güveniyor stereolojik sistemleri, bilgisayar tabanlı bir dizi vardır. 2 yaşındaki vervets serebral korteks toplam nöronal nüfusu 0,042 ortalama CE ile 828 milyon (Şekil 3) üzerinde olduğu tahmin etmek BioQuant Yaşam Bilimleri sistemi kullandık. Biz sonradan tahmin Stereologer sistemi kullanılmaktadır kortikal nöronların yaklaşık yarısı sayısı 8 frontal lob hesapları.
Şekil 1 Bilgisayar tabanlı Stereology Sistemleri. Stereology sistemlerinin temel set-up (xyz) motorlu bir sahne ile aynı, bir mikroskop, bir sahne denetleyicisi, video kamera, bilgisayar ve yazılım. Sonuçta seçilen sistemin verimliliği, ihtiyaç ve maliyet analizi dayalı olmalıdır.
| ÇALIŞMA BİLGİLER | |
| Çalışma Adı | Frontal Korteks |
| Baş Araştırmacı | MB |
| Tür | AG |
| Referans Uzay Frontal | Cortex |
| Notlar | |
| VAKA BİLGİ | |
| Veri Toplayıcı | MB |
| Tarih | Çarşamba, 30 Nisan 2008 |
| Grup | Kontrol |
| Konu | Ø26 |
| Notlar | |
| ÖRNEKLEME ÖZELLİKLERİ | |
| Döşeme Örnekleme Aralığı | 1 |
| Bölümler Sayısı | 760 |
| Bölüm Örnekleme Aralığı | 59 |
| Başlangıç Bölüm | 2 |
| FRAKSIYONLARI | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| SONUÇLAR ÖZET | |||||
| Parametre | Sonda | Isim | Sonuç | CE | SD |
| Kalınlık | --- | --- | 17,8996 μ | --- | --- |
| Numara | Disektör | nöron | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Hacim | Cavalieri Noktası Grid | hacim | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| ÖNERİLER | |
| Sonda | Nesne sayısı (nöron) |
| CE | 0,0474 |
| Öneriler | CE kabul edilebilir. |
| İzlenen Disectors Sayısı Çok Yüksek, disektör Aralığı artırın. | |
| Sonda | Bölge Hacmi (hacmi) |
| CE | 0,0078 |
| Öneriler | CE kabul edilebilir. |
| BÖLÜM SONUÇLAR | ||
| Bölüm | nöron nöron NumCorners NumObjects | hacmi RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9 - 52 | 100 | 77 |
| 10 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Şekil 2 Stereologer Sistemi ile Elde Edilen Fontal Lob Sonuçları frontal lob, stereolojik sürecinin uzun parçası sistematik örnekleme ve kesit. Topoğrafya, hacim ve nöronal satışta her konu hakkında bir gün içinde tamamlanmıştır. Sol hemisfer örnekleri alındı ve bu sayı her iki yarımkürede için yaklaşık bir tahmin metin iki katına çıkar.
Şekil 3 Cortex Nöronal Nüfus Tahmini BioQuant ile elde edildi. BioQuant sistemi, hücre sayımı öncesinde tam bir topografya gerektirir . İşte 13 bölümden ortalama örneklendi. Kortikal topografya ve sonraki hacmi tahmini, her konu için 15-20 saat arasında sürmüştür. Topoğrafya 2.5x objektif altında yapıldı ve sayım 100x immersiyon yağı hedefi (NA 1.3) kullanılarak yapıldı. 100. Her bölümde ortalama 180 disectors örneklenmiş ile sol hemisfer boyunca seçildi. Nöronal sayma topografyası tamamlandıktan sonra yaklaşık bir gün sürmüştür. Sol hemisfer örnekleri alındı ve bu sayı her iki yarımkürede için yaklaşık bir tahmin metin iki katına çıkar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primat beyin hakkında tarafsız stereology diğer biyolojik örneklerin benzer. Bununla birlikte, 50μm az dilimlenmiş vervet maymun tek bir yarımkürede 1200'den fazla bölüm verir primat beynin büyüklüğü göz önüne alındığında, dikkatli bir işleme planı önerilir. Öncelikle stereotaxically 1cm blokları, blok ve konular arasındaki bölümün standart bir düzlemde sağlar bloklar arasında kısmi bölümleri en aza indirir ve yönetilebilir büyüklükte bloklar 5 sağlar beynin engelleme tavsiye ederiz . Stereology için çok önemli bir adım gibi sistematik örnekleme 6-10 bölümler referans bölge ile elde edilir. Primat beyin için, bu uzun vadeli araştırma planları 6 için korumak antijen doku bankacılık öneririm her bir beyin elde olası veri maksimize etmek için, bu yüzden önemli miktarda işlenmemiş malzeme bırakır. Doku çevrilir, maymun beyni hedef proteinlerin belirlenmesi için sistematik bir İmmuno yaklaşım stereology 9 için hazırlanmış olabilir. Korteks veya loblar gibi daha geniş alanlar önce potansiyel ilgi küçük referans uzayda en az 10 bölüm için bir plan yapılmalıdır kesit için, 10-14 bölümleri gerekebilir. Bir pilot çalışma da stereolojik çalışma parametrelerini ayarlamak için bir kontrol konusu yapılmalıdır. Ayrıca yayınlanan stereolojik verileri sunmak veya sözlü asf, tsf, ssf, ve Σ Q uygun CE değerleri ile birlikte rapor edilmelidir zaman.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Ikiel Ptito onun devam eden teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. MP NSERC hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
