Summary
HC11 lactogenic भेदभाव गुंबददार mammospheres के रूप में संदर्भित संरचनाओं के गठन के द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है. lactogenic भेदभाव बढ़ाता में सहायता संरचनाओं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा enumerated हो सकता है है.
Abstract
एक प्ररूपी सामान्यतः करने के लिए माउस स्तन उपकला सेल संस्कृतियों में lactogenic भेदभाव की डिग्री का निर्धारण किया जाता उपाय गुंबद के आकार सेल संरचनाओं के गठन mammospheres के रूप में संदर्भित है
Protocol
- HC11 कोशिकाओं RPMI १६४० 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 5μg/ml इंसुलिन, 10 मिमी HEPES, 10ng/ml epidermal वृद्धि कारक (EGF) क्षमता की स्थापना के साथ पूरक मध्यम में 6 दिनों के लिए संगम हो गया.
- कोशिकाओं पीबीएस के साथ धोया गया और 24 घंटे के लिए EGF के बिना विकास मीडिया में बनाए रखा.
- Lactogenic भेदभाव प्रेरित कोशिकाओं भेदभाव मीडिया, यानी dexamethasone के साथ RPMI (10 एम -6), इंसुलिन (5 μg / एमएल) और (5 / μg मिलीलीटर) प्रोलैक्टिन डुबकी के रूप में संदर्भित में incubated रहे थे.
- कहा समय के बाद डुबकी अलावा, mammospheres फोटो खिंचवाने थे और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा डिजिटल कैमरा के साथ एक ओलिंप IX71 माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रगणित.
प्रतिनिधि परिणाम:
सामान्य स्तन उपकला सेल monolayers और एकाधिक mammospheres की कम शक्ति बढ़ाई, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक एकल mammosphere के उच्च शक्ति बढ़ाई चित्र 1 में दिखाया जाता है, क्रमशः. 
चित्रा 1. Mammospheres (क) सामान्य स्तन उपकला सेल monolayers मिला हुआ कोशिकाओं के एक फ्लैट परत के रूप में प्रदर्शित किया जाना चाहिए. (ख) डुबकी उत्तेजना के 3-5 दिनों के बाद एकाधिक mammospheres दिखाई देते हैं. तस्वीर ले लिया है 5 दिनों डुबकी अलावा पोस्ट. (ग) एक एकल डुबकी अलावा पोस्ट 5 दिन mammospheres युक्त क्षेत्र के उच्च बढ़ाई.
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Discussion
इस तकनीक के लिए आदेश में सफल होने के लिए और अच्छी गुणवत्ता की, उपकला कोशिकाओं संगम पर रखा होना चाहिए पहले lactogenic हार्मोन के साथ प्रेरित किया जा रहा है. वहाँ स्थितियों जहाँ वहाँ कई mammospheres, जो मात्रा का ठहराव कठिन बना देता है हो सकता है. इस प्रकार, मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए यह सबसे अच्छा है एक समय बिंदु पर mammospheres तस्वीर जब mammospheres की संख्या को गिना जा सकता है.
जबकि वहाँ विभिन्न आणविक मार्करों स्तन उपकला कोशिकाओं के lactogenic भेदभाव की डिग्री का निर्धारण किया जाता हैं, वहाँ कुछ रूपात्मक 2D संस्कृति में विकसित कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया मार्करों हैं. उपकला कोशिका monolayers की क्षमता लघु गुंबद संरचनाओं जहां दूध प्रोटीन जमा कर सकते हैं के रूप में एक विधा है जिसके द्वारा morphological परिवर्तन है कि इस विकास की प्रक्रिया के दौरान होते नजर रखी जा सकता है प्रदान करता है.
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Acknowledgments
Congressionally निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान फंड अनुदान (DAMD17-01-0,264) से एमएल कटलर और संयुक्त राज्य अमेरिका सैन्य कैंसर एमएल कटलर संस्थान फंड काम का समर्थन किया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
