Summary
HC11 lactogenic 차별화는 mammospheres이라고 돔 구조의 형성에 의해 특징 수 있습니다. 구조 lactogenic 차별 quantifying에 투입 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거 수 있습니다.
Abstract
일반적으로 내유 마우스 상피 세포 배양에 lactogenic 분화의 정도를 결정하는 데 사용 phenotypic 측정 mammospheres이라고 돔 모양의 세포 구조의 형성이다
Protocol
- HC11 세포 10% 소태아 혈청, 5μg/ml 인슐린, 10 MM HEPES, 능력을 확립하기 위해 10ng/ml 표피 성장 인자 (EGF)와 보충 RPMI 1640 배지에서 6 일간 합류로 성장했다.
- 세포는 PBS로 씻어 24 시간 동안 EGF없이 성장 미디어에 유지했다.
- lactogenic 차별을 유발하는 세포 차별화 미디어, dexamethasone과 함께 즉 RPMI (10 -6 M), 인슐린 (5 μg / ML)과 같은 DIP라고 prolactin (5 μg / ML)에 incubated했다.
- 명시된 시간 이후 DIP 추가에서 mammospheres이 찍은 디지털 카메라 올림푸스 현미경 IX71를 사용하여 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거.
대표 결과 :
정상 내유 상피 세포 monolayers 여러 mammospheres의 낮은 전력 확대뿐만 아니라 단일 mammosphere의 높은 전력 배율은 각각 그림 1에 표시됩니다. 
그림 1. Mammospheres가. () 일반 내유 상피 세포 monolayers가 합류 세포의 평면 레이어로 표시되어야합니다. (B) DIP 자극 3-5일 후 여러 mammospheres이 나타납니다. 사진은 5 일 DIP 또한 게시 촬영. DIP 또한 게시물 오일에 mammospheres를 포함하는 단일 필드 (C) 고등 확대.
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Discussion
위해서는이 기술에 대한 성공과 최고의 품질의 상피 세포가 lactogenic 호르몬으로 유도되고 이전에 합류 유지되어야합니다. 부량 어려운 만드는 수많은 mammospheres가있다 상황이있을 수 있습니다. 따라서, 정량 목적은 mammospheres의 숫자가 계산되는 수있는 때 시점에서 mammospheres을 사진에 좋습니다.
내유 상피 세포의 분화 lactogenic에 노출된 정도를 확인하는 데 사용되는 다양한 분자 마커가 있지만, 2D 문화 속에서 자란 세포를 사용 몇 형태학의 표식이있다. 우유 단백질이 누적될 수 모형 돔 구조를 형성 상피 세포 monolayers의 능력이 발달 과정에서 발생하는 형태학의 변경 사항 모니터링 할 수있는 모드를 제공합니다.
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Acknowledgments
Congressionally 감독 의학 연구 기금 부여 (DAMD17 - 01-0264)에서 ML 커틀러와 ML 커틀러하는 방법 United States 군사 암 연구소에 기금이 작업을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
