Summary
ويمكن وصف HC11 تمايز المولد للبن من تشكيل هياكل القبة ويشار إلى mammospheres. ويمكن تعداد هياكل بواسطة المجهر النقيض من المرحلة للمساعدة في قياس تمايز المولد للبن.
Abstract
قياس المظهري تستخدم عادة لتحديد درجة التمايز المولد للبن الثدي في الخلايا الظهارية الماوس الثقافات هو تشكيل خلية على شكل قبة هياكل ويشار إلى mammospheres
Protocol
- ونمت الخلايا HC11 لالتقاء لمدة 6 أيام في المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين ، 5μg/ml الأنسولين ، 10 HEPES مم ، 10ng/ml عامل نمو البشرة (EGF) لتأسيس اختصاصها.
- تم غسلها مع الخلايا والحفاظ عليها في برنامج تلفزيوني وسائط النمو دون EGF لمدة 24 ساعة.
- للحث على تمايز المولد للبن وحضنت الخلايا في التمايز وسائل الإعلام ، أي RPMI مع ديكساميثازون (10 -6 م) ، والانسولين (5 ميكروغرام / مل) ، والبرولاكتين (5 ميكروغرام / مل) على النحو المشار إليه DIP.
- بالإضافة إلى ذلك ذكرت في مجمع دبي للاستثمار بعد مرة ، وصورت mammospheres تعداد بواسطة المجهر النقيض من المرحلة باستخدام المجهر IX71 أوليمبوس مع كاميرا رقمية.
ممثل النتائج :
وتظهر انخفاض قوة التكبير العادية الثديية monolayers الخلايا الظهارية وmammospheres متعددة ، فضلا عن ارتفاع تضخم السلطة التي يتمتع بها mammosphere واحد في الشكل رقم 1 ، على التوالي. 
الشكل 1. Mammospheres. (أ) ينبغي أن يكون عرض عادي الثديية monolayers الخلايا الظهارية كطبقة مسطحة من الخلايا متموجة. (ب) بعد 3-5 أيام من DIP التحفيز mammospheres متعددة تظهر. صورة التقطت 5 أيام آخر DIP الإضافة. (ج) التكبير العالي من حقل واحد يحتوي على mammospheres في 5 أيام آخر DIP الإضافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل هذه التقنية لتكون ناجحة وأفضل نوعية ، ويجب المحافظة على الخلايا الظهارية في التقاء قبل أن يسببها مع الهرمونات المولد للبن. قد تكون هناك حالات حيث توجد العديد من mammospheres ، مما يجعل من الصعب تقدير. وهكذا ، لأغراض الكمية فمن الأفضل لتصوير mammospheres في نقطة الوقت الذي كان فيه عدد من mammospheres قادرة على أن تحسب.
في حين أن هناك علامات الجزيئية المختلفة المستخدمة لتحديد درجة تمايز الخلايا الظهارية من المولد للبن الثدي ، وهناك علامات قليلة الصرفية المستخدمة الخلايا المزروعة في الثقافة 2D. monolayers قدرة الخلايا الظهارية لتشكيل هياكل مصغرة القبة حيث يمكن أن تتراكم بروتينات الحليب يوفر النمط الذي يمكن رصد التغيرات المورفولوجية التي تحدث أثناء هذه العملية التنموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
يؤيد إخراج الأموال من الكونغرس للبحوث الطبية منحة الصندوق (DAMD17 - 01-0264) إلى كاتلر ML والولايات المتحدة العسكرية لمعهد السرطان كاتلر ML العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
