Summary
HC11 lactogenic differentiatie kan worden gekenmerkt door de vorming van overkoepelde bedoelde structuren als mammospheres. De structuren kunnen worden opgesomd door de fase-contrast-microscopie om te helpen bij het kwantificeren van lactogenic differentiatie.
Abstract
Een fenotypische die vaak wordt gebruikt om de mate van lactogenic differentiatie in muis borstklieren epitheelcellen culturen te bepalen, is de vorming van koepelvormige celstructuren aangeduid als mammospheres
Protocol
- De HC11 cellen werden gekweekt tot confluentie gedurende 6 dagen in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal kalf serum, 5μg/ml insuline, 10 mM HEPES, 10ng/ml epidermale groeifactor (EGF) de bekwaamheid vast te stellen.
- De cellen werden gewassen met PBS en onderhouden groei media zonder EGF voor 24 uur.
- Voor het induceren van lactogenic differentiatie van de cellen werden geïncubeerd in differentiatie media, dat wil zeggen RPMI met dexamethason (10 -6 M), insuline (5 ug / ml) en prolactine (5 ug / ml) aangeduid als DIP.
- Op de aangegeven tijden post-DIP Daarnaast werden mammospheres gefotografeerd en geïnventariseerd door fase-contrast-microscopie met behulp van een Olympus IX71 microscoop met digitale camera.
Representatieve resultaten:
Laag stroomverbruik vergroting van de normale borstklier epitheliale celmonolagen en meerdere mammospheres, evenals een hoog vermogen vergroting van een enkele mammosphere zijn weergegeven in figuur 1, respectievelijk. 
Figuur 1. Mammospheres. (A) Normale borstklieren epitheelcellen monolayers moet worden weergegeven als een vlakke laag van samenvloeiende cellen. (B) Na 3-5 dagen van de DIP-stimulatie meerdere mammospheres verschijnen. Foto genomen vijf dagen na de DIP-toevoeging. (C) Hogere vergroting van een veld met mammospheres na 5 dagen na de DIP-toevoeging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om deze techniek succesvol te zijn en van de beste kwaliteit, de epitheliale cellen moet worden gehandhaafd op samenloop alvorens te worden geïnduceerd met lactogenic hormonen. Er kunnen situaties zijn waarin er talrijke mammospheres, waardoor de kwantificering moeilijk. Dus, voor kwantitatieve doeleinden is het best om de mammospheres fotograferen op een tijdstip als het aantal mammospheres is in staat moet worden geteld.
Hoewel er verschillende moleculaire merkers worden gebruikt om de mate van lactogenic differentiatie van mamma-epitheliale cellen te bepalen, zijn er weinig morfologische merkers gebruikt voor cellen gekweekt in 2D cultuur. Het vermogen van epitheliale cel monolagen aan miniatuur koepel structuren waar de melk eiwitten kunnen ophopen formulier biedt een modus waarbij de morfologische veranderingen die optreden tijdens dit ontwikkelingsproces kan worden gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Fondsen uit Congressionally Geregisseerd Medical Research Fund-subsidie (DAMD17-01-0264) naar ML Cutler en de Verenigde Staten militaire Kanker Instituut naar ML Cutler wordt ondersteund het werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
