Summary
HC11 différentiation lactogène peut être caractérisée par la formation de structures en forme de dôme appelé mammospheres. Les structures peuvent être énumérés par microscopie à contraste de phase afin d'aider à quantifier différentiation lactogène.
Abstract
Une mesure phénotypique communément utilisé pour déterminer le degré de différenciation dans le lactogène mammaire de la souris des cultures de cellules épithéliales est la formation de structures cellulaires en forme de dôme appelé mammospheres
Protocol
- Le HC11 cellules ont été cultivées à confluence pendant 6 jours en milieu RPMI 1640 complété avec du sérum de veau foetal à 10%, l'insuline 5μg/ml, HEPES 10 mM, 10ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF) pour établir la compétence.
- Les cellules ont été lavées avec du PBS et maintenus dans un milieu de croissance sans EGF pendant 24 heures.
- Pour induire la différenciation lactogène les cellules sont incubées dans les médias de différenciation, c'est à dire RPMI avec la dexaméthasone (10 -6 M), l'insuline (5 ug / ml) et la prolactine (5 ug / ml) appelé DIP.
- A la fois affirmé après-DIP outre, mammospheres ont été photographiés et énumérés par microscopie à contraste de phase en utilisant un Olympus IX71 microscope avec appareil photo numérique.
Les résultats représentatifs:
Faible grossissement des monocouches de cellules mammaires normales épithéliales et mammospheres multiples, ainsi que de grossissement de haute puissance d'une seule mammosphere sont présentés dans la figure 1, respectivement. 
Figure 1. Mammospheres. (A) mammaire normale monocouches de cellules épithéliales devrait être affichée comme une couche plane de cellules confluentes. (B) Après 3-5 jours de la stimulation DIP mammospheres multiples apparaissent. Photographie prise cinq jours après DIP addition. (C) Plus fort grossissement d'un champ unique contenant mammospheres à 5 jours après l'ajout DIP.
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Discussion
Pour que cette technique soit réussie et de la meilleure qualité, les cellules épithéliales doivent être maintenues à confluence avant d'être induites par des hormones lactogènes. Il peut y avoir des situations où il ya de nombreuses mammospheres, ce qui rend la quantification difficile. Ainsi, à des fins quantitatives, il est préférable de photographier les mammospheres à un point alors que le nombre de mammospheres est capable d'être comptés.
Bien qu'il existe différents marqueurs moléculaires utilisés pour déterminer le degré de différenciation lactogène de cellules épithéliales mammaires, il ya peu de marqueurs morphologiques utilisées pour les cellules en culture 2D. La capacité des monocouches de cellules épithéliales pour former des structures de dôme miniature où les protéines du lait peuvent s'accumuler fournit un mode par lequel les changements morphologiques qui se produisent pendant ce processus de développement peuvent être surveillés.
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Acknowledgments
Les fonds provenant dirigé par le Congrès Fonds de recherche médicale de subvention (DAMD17-01-0264) à ML Cutler et Etats-Unis Militaire Cancer Institute à ML Cutler a soutenu le travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
