Summary
HC11 differenziazione lattogenica può essere caratterizzata dalla formazione di strutture a cupola denominata mammospheres. Le strutture possono essere elencati mediante microscopia a contrasto di fase per aiutare a quantificare la differenziazione lattogenica.
Abstract
Una misura fenotipica comunemente usato per determinare il grado di differenziazione lattogenica nel topo colture di cellule epiteliali mammarie è la formazione di strutture cellulari a forma di cupola denominata mammospheres
Protocol
- Il HC11 cellule sono state coltivate a confluenza per 6 giorni in RPMI 1640 medium supplementato con 10% di siero di vitello fetale, insulina 5μg/ml, 10 HEPES mM, 10ng/ml fattore di crescita epidermico (EGF) per stabilire la competenza.
- Le cellule sono state lavate con PBS e mantenuti in terreni di coltura senza FEG per 24 ore.
- Per indurre la differenziazione lattogenica le cellule sono state incubate nei media differenziazione, cioè RPMI con desametasone (10 -6 M), l'insulina (5 mg / ml) e prolattina (5 mg / ml) di cui il DIP.
- A volte affermato post-DIP Inoltre, mammospheres sono stati fotografati ed enumerate mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un microscopio Olympus IX71 con fotocamera digitale.
Rappresentante dei risultati:
Ingrandimento di bassa potenza normale monostrati di cellule epiteliali mammarie e mammospheres multiple, così come ingrandimento ad alta potenza di una singola mammosphere sono mostrati in figura 1, rispettivamente. 
Figura 1. Mammospheres. (A) normale monostrati di cellule epiteliali mammarie deve essere visualizzato come uno strato piatto di cellule confluenti. (B) Dopo 3-5 giorni di stimolazione DIP mammospheres più apparire. Fotografia scattata 5 giorni dopo DIP aggiunta. (C) ingrandimento superiore di un singolo campo contenente mammospheres a 5 giorni dopo DIP aggiunta.
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Discussion
Affinché questa tecnica per avere successo e di ottima qualità, le cellule epiteliali deve essere mantenuta a confluenza prima di essere indotto con gli ormoni lattogenica. Ci possono essere situazioni in cui ci sono mammospheres numerosi, il che rende difficile la quantificazione. Così, ai fini quantitativa è meglio fotografare la mammospheres in un punto momento in cui il numero di mammospheres è in grado di essere contati.
Mentre ci sono diversi marcatori molecolari per determinare il grado di differenziazione lattogenica di cellule epiteliali mammarie, ci sono pochi marcatori morfologici utilizzati per le cellule in coltura 2D. La capacità di monostrati di cellule epiteliali a formare strutture a cupola in miniatura in cui le proteine del latte possono accumulare fornisce una modalità con cui i cambiamenti morfologici che si verificano durante questo processo di sviluppo può essere monitorato.
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Acknowledgments
Diretto da fondi dal Congresso per la ricerca medica del Fondo di finanziamento (DAMD17-01-0264) di ML Cutler e United States Military Cancer Institute di ML Cutler sostenuto il lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
