Summary
HC11 בידול lactogenic יכול להיות מאופיין על ידי היווצרות של מבנים כיפה המכונה mammospheres. מבנים ניתן המנויים על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לסייע לכימות בידול lactogenic.
Abstract
מדד פנוטיפי נפוץ כדי לקבוע את מידת הבידול lactogenic בתוך החלב עכבר תרבויות אפיתל התא הוא היווצרות של מבנים דמויי כיפה תא המכונה mammospheres
Protocol
- HC11 התאים גדלו על מפגש עבור 6 ימים בינוני 1640 RPMI בתוספת סרום 10% עגל עוברית, אינסולין 5μg/ml, HEPES 10 מ"מ, צמיחה 10ng/ml גורם אפידרמיס (EGF) להקים יכולת.
- התאים נשטפו עם PBS ומתוחזק בתקשורת צמיחה ללא EGF למשך 24 שעות.
- כדי להשרות התמיינות lactogenic התאים הודגרו בתקשורת בידול, כלומר RPMI עם dexamethasone (10 -6 M), אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל) ופרולקטין (5 מיקרוגרם / מ"ל) המכונה מח"ש.
- בנוסף לכל פוסט מח"ש פעמים כאמור, mammospheres צולמו המנויים על ידי מיקרוסקופית השלב בניגוד באמצעות מיקרוסקופ IX71 אולימפוס עם מצלמה דיגיטלית.
נציג תוצאות:
הגדלה חשמל נמוכה של החלב monolayers נורמלי לתא אפיתל mammospheres מרובים, כמו גם הגדלה של מתח גבוה mammosphere יחיד מוצגים באיור 1, בהתאמה. 
באיור 1. Mammospheres. (א) רגיל monolayers החלב תא אפיתל צריך להיות מוצג כשכבת שטוחה של תאים ומחוברות. (ב) לאחר 3-5 ימים של גירוי מח"ש mammospheres מרובים תופיע. צולם 5 ימים הודעה מח"ש בנוסף. (ג) הגדלה גבוהה של שדה יחיד המכיל mammospheres ב 5 ימים שלאחר בנוסף מח"ש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת הטכניקה הזו להיות מוצלחת באיכות הטובה ביותר, את לתאי האפיתל יש לשמור על מפגש קודם להיות מושרה עם הורמונים lactogenic. ייתכנו מצבים שבהם יש mammospheres רבים, מה שהופך את כימות קשה. לפיכך, למטרות כמותי עדיף לצלם את mammospheres בנקודת הזמן כאשר מספר mammospheres מסוגל לסמוך.
אמנם יש סמנים מולקולריים שונים כדי לקבוע את מידת הבידול lactogenic לתאי האפיתל של השד, יש כמה סמנים מורפולוגיים המשמשים בתאי צמח בתרבות 2D. היכולת של monolayers תא אפיתל ליצירת מבנים זעירים הכיפה איפה חלבונים חלב יכול לצבור מספק מצב לפיו שינויים מורפולוגיים המתרחשים במהלך תהליך התפתחותי זה יכול להיות פיקוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
קרנות מ בימוי congressionally למחקר רפואי הקרן מענק (DAMD17-01-0264) ל ML קטלר ארצות הברית הצבאית מכון הסרטן כדי ML קטלר נתמך העבודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
