Summary
HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.
Abstract
Uma medida fenotípicas comumente usado para determinar o grau de diferenciação do mouse em lactogênica mamárias culturas de células epiteliais é a formação de estruturas celulares em forma de cúpula referido como mammospheres
Protocol
- O HC11 células foram cultivadas a confluência de seis dias em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, insulina 5μg/ml, 10 mM HEPES, fator de crescimento 10ng/ml epidérmico (EGF) para estabelecer competência.
- As células foram lavadas com PBS e mantidos em meio de crescimento sem EGF por 24 horas.
- Para induzir a diferenciação lactogênica as células foram incubadas em meios de diferenciação, isto é, RPMI com dexametasona (10 -6 M), a insulina (5 mg / ml) e prolactina (5 mg / ml) conhecido como DIP.
- No horário mencionado além de pós-DIP, mammospheres foram fotografados e enumerados por microscopia de contraste de fase utilizando um microscópio Olympus IX71 com câmera digital.
Resultados representativos:
Ampliação de baixa potência do normal mamárias monocamadas de células epiteliais e mammospheres múltiplos, bem como de ampliação de alta potência de uma única mammosphere são mostrados na Figura 1, respectivamente. 
Figura 1. Mammospheres. (A) Normal monocamadas de células epiteliais mamárias deve ser exibido como uma camada plana de células confluentes. (B) Após 3-5 dias de DIP estimulação mammospheres múltiplas aparecer. Fotografia tirada 5 dias pós-DIP disso. (C) Maior aumento de um único campo contendo mammospheres a 5 dias após o DIP disso.
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Discussion
Para que esta técnica seja bem sucedida e da melhor qualidade, as células epiteliais deve ser mantida a confluência antes de ser induzidos com hormônios lactogênese. Pode haver situações em que há mammospheres numerosas, o que torna a quantificação difícil. Assim, para fins quantitativos, é melhor para fotografar a mammospheres em um ponto de tempo quando o número de mammospheres é capaz de ser contado.
Embora existam diversos marcadores moleculares utilizados para determinar o grau de diferenciação lactogênica de células epiteliais mamárias, existem alguns marcadores morfológicos utilizados para as células cultivadas em cultura em 2D. A capacidade de monocamadas de células epiteliais para formar estruturas de cúpula em miniatura, onde as proteínas do leite pode acumular fornece um modo pelo qual as alterações morfológicas que ocorrem durante este processo de desenvolvimento podem ser monitorados.
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Acknowledgments
Dirigido pelo Congresso de fundos Medical Research Fund subvenção (DAMD17-01-0264) para ML Cutler e Militar dos Estados Unidos Cancer Institute para ML Cutler apoiou o trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
