Summary
HC11 diferenciación lactogénica se caracteriza por la formación de estructuras abovedadas conocida como mammospheres. Las estructuras se pueden enumerar por microscopía de contraste de fases para ayudar en la cuantificación de la diferenciación lactogénica.
Abstract
A medida fenotípica comúnmente utilizado para determinar el grado de diferenciación en lactogénica mamario de ratón cultivos de células epiteliales es la formación de estructuras en forma de cúpula de la célula conocida como mammospheres
Protocol
- El HC11 células fueron cultivadas hasta confluencia durante 6 días en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, insulina 5μg/ml, HEPES 10 mM, el factor de 10ng/ml crecimiento epidérmico (EGF) la debida competencia.
- Las células fueron lavadas con PBS y se mantiene en los medios de crecimiento sin EGF durante 24 horas.
- Para inducir la diferenciación lactogénica las células fueron incubadas en medio de diferenciación, es decir, RPMI con dexametasona (10 -6 M), insulina (5 mg / ml) y la prolactina (5 mg / ml) se refiere a disminuir a medida.
- En el momento indicado post-DIP Además, mammospheres fueron fotografiados y se enumeran por microscopía de contraste de fase con una Olympus IX71 microscopio con cámara digital.
Los resultados representativos:
Ampliación de potencia bajo de lo normal monocapas de células epiteliales mamarias y mammospheres múltiples, así como la ampliación de potencia de alta de un mammosphere solo se muestran en la Figura 1, respectivamente. 
Figura 1. Mammospheres. (A) Normal monocapas de células epiteliales mamarias debe mostrarse como una capa plana de células confluentes. (B) Después de 3-5 días de estimulación DIP mammospheres aparecen múltiples. Fotografía tomada 5 días post DIP adición. (C) Mayor aumento de un solo campo que contiene mammospheres menos 5 días después de la DIP adición.
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Discussion
Para que esta técnica tenga éxito y sea de la mejor calidad, las células epiteliales se debe mantener en la confluencia antes de ser inducido con hormonas lactogénica. Puede haber situaciones en las que se mammospheres numerosas, lo que hace difícil la cuantificación. Por lo tanto, a efectos cuantitativos, es mejor para fotografiar el mammospheres en un punto de tiempo cuando el número de mammospheres es capaz de ser contados.
Si bien existen diversos marcadores moleculares para determinar el grado de diferenciación lactogénica de las células epiteliales mamarias, son pocos los marcadores morfológicos utilizados para las células cultivadas en la cultura en 2D. La capacidad de las monocapas de células epiteliales para formar estructuras en miniatura cúpula donde se puede acumular proteínas de la leche tiene un modo por el cual los cambios morfológicos que se producen durante este proceso de desarrollo se puede controlar.
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Acknowledgments
Fondos de el Congreso de Investigación Médica Dirigida subvención del Fondo (DAMD17-01-0264) a ML Cutler y militar de Estados Unidos Instituto de Cáncer de ML Cutler apoyó el trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
