Summary
Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.
Abstract
הכנת תא בודד השעיות מרקמות היא תנאי חשוב ניסויים רבים במחקר הסלולר. תהליך dissociating איברים שלם דורש פרמטרים ספציפיים על מנת לקבל מספר גבוה של תאים חיים בצורה לשחזור. Dissociator gentleMACS מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. המכשיר מכיל מתוכנתים מראש הגדרות מותאמות דיסוציאציה היעילה אך עדין של מגוון רחב של סוגי רקמות, כולל הריאות העכבר. בפרסום זה השימוש Dissociator gentleMACS על רקמת הריאה נגזר עכברים מודגם.
Protocol
כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית.
1. חומרים
- HEPES חיץ: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2)
- Collagenase פתרון D: collagenase D: 100 מ"ג / מ"ל (collagenase D> 0.15 U / מ"ג), ב HEPES חיץ
- DNase פתרון אני: 20,000 U / mL DNase אני
- PBS חוצץ ב-pH 7.2
- PEB חיץ: 1 חלק BSA במלאי פתרון ב 20 חלקים autoMACS פתרון שטיפה
- רקמות: ריאות הנגזרות 6 / 7 שבוע הישן נקבה בוגרת BALB / C העכבר, ללא איברים סמוכים.
- אופציונלי: microbeads CD11c, MACS עמודות MS, MACS מפריד עבור בידוד של תאים דנדריטים מן ההשעיה ריאות תא בודד העכבר
2. Dissociating רקמת הריאה
- יש לשטוף את רקמת בצלחת פטרי המכילות PBS להסיר אריתרוציטים.
- העברה מרבי של רקמת הריאה עד 450 מ"ג Tube gentleMACS C המכיל 4.9 מ"ל HEPES חיץ.
- הוספת 100 μL פתרון D collagenase לריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל collagenase ד
- הוסף 10 פתרון μL DNase אני בעד רקמה 150 מ"ג (הריכוז הסופי של 40 U / ml DNase אני) או 20 μL DNase אני עבור רקמת הריאה 150-450 מ"ג (הריכוז הסופי של 80 U / mL DNase אני).
- חזק לסגור את Tube C וצרף אותו על Dissociator gentleMACS. ואז להפעיל את התוכנית "m_lung_01".
- דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות עם סיבוב אוטומטי או ידני להפוך כל 5 דקות.
- חזור מדגם Dissociator gentleMACS ולהפעיל את התוכנית "m_lung_02".
3. סינון
- הכן צינורית 50 מ"ל לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת מכסה עם מסננת רשת 70 מיקרומטר התא.
- לאחר תוכנית second gentleMACS מסתיים, בהתאם לחלוקת חומר מדגם בצינור, ייתכן צנטריפוגות הצינור קצר כדי לאסוף את החומר מדגם בחלק התחתון של הצינור.
- הסר את התאים באמצעות כובע חתום של מחצה התחתית C באמצעות קצה מתאים 1000 פיפטה μl ולהחיל אותן על מסננת את התא.
- שטפו את מסננת תא עם חיץ HEPES 5 מ"ל ב RT.
- צנטריפוגה את התאים גלולה בצינור 50 מ"ל ב 300xg במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה בהיקף הרצוי מאגר PEB.
חלק 4: תוצאות נציג:
באיור 1. הביאה ריאות דיסוציאציה עם ™ gentleMACS Dissociator בתאים קיימא 92%. תאים מתים היו מוכתמים fluorescently עם יודיד propidium (PI) (העלילה נקודה הנכונה; העלילה נקודה שמאל: לא מכתים PI).
איור 2. דיסוציאציה של רקמת הריאה באמצעות העכבר את התוצאות Dissociator gentleMACS באחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. נגזר תא בודד השעיות הוכתמו CD45-PE ו-CD146 FITC או CD31-FITC ונותחו על ידי cytometry הזרימה.
איור 3. תא בודד ההשעיה נבעה רקמת הריאה העכבר היה מוכתם CD11c-FITC ואנטי mPDCA-1-APC לאתר עכבר CD11c נמוך מ-PDCA-1 + DCs plasmacytoid כמו גם תאים גבוה CD11c.
איור 4. והעשרה של תאים דנדריטיים באמצעות microbeads CD11c, מפריד MiniMACS ושני טורים MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה, אנו מציגים שיטה חדשה דיסוציאציה של רקמת הריאה העכבר. אנו מראים כי שילוב של טיפול מכני האנזימטית של רקמת הריאה הניבו אחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. באופן ספציפי, התפוררות מכנית של רקמת הושגה על ידי Dissociator gentleMACS. C צינורות gentleMACS כוללים הרוטור - מערכת הסטטור, אשר מנתק רקמות בצורה עדינה. הליך זה נשלט על ידי הגדרות התוכנית של המכשיר. ההגדרות היו אופטימיזציה כדי להשיג תשואה גבוהה הכדאיות של תאים. נגזר תא בודד השעיות הוכתמו CD45-PE ו-CD146 FITC או CD31-FITC ונותחו על ידי זרימת cytometry לזהות לויקוציטים ותאי האנדותל. תאים דנדריטים ההשעיה מתא בודד הוכתמו CD11c-FITC ואנטי mPDCA-1-APC. יתר על כן, תאים דנדריטים מן השעיה ריאות תא בודד עכבר היו מועשר באמצעות טכנולוגיה MACS:. תאים דנדריטים תויגו מגנטית באמצעות microbeads CD11c ומופרד באמצעות מפריד MiniMACS ועמודות MS 1,2 ככלל, שילוב של ניתוק החדש שלנו עם פרוטוקול מיון התא המגנטי מייצג שיטה סטנדרטית להשיג סוגי תאים מסוימים של רקמת הריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
