Summary
Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para la agitación del tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido pulmonar se explica.
Abstract
La preparación de una sola célula suspensiones de tejidos es un requisito importante para muchos experimentos en la investigación celular. El proceso de disociación de órganos enteros requiere parámetros específicos a fin de obtener un alto número de células viables de manera reproducible. El disociador gentleMACS optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. El instrumento contiene ajustes pre-programados que se han optimizado para la disociación eficaz, pero suave de una gran variedad de tipos de tejidos, incluyendo los pulmones del ratón. En esta publicación, el uso de la disociador gentleMACS en el tejido pulmonar derivados de ratones se ha demostrado.
Protocol
Para trabajar en condiciones estériles, se recomienda llevar a cabo todos los pasos en una campana de flujo laminar.
1. Materiales
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
- Colagenasa D solución: colagenasa D: 100 mg / mL (colagenasa D> 0,15 U / mg), en tampón HEPES
- DNasa I solución: 20.000 U / ml DNasa I
- Tampón PBS a pH 7,2
- PEB búfer: 1 parte de solución de archivo de BSA en 20 partes autoMACS solución de lavado
- Tejidos: pulmón derivado de niño de 6 / 7 semanas adulto hembra Balb / c ratón, libre de los órganos adyacentes.
- Opcional: MicroBeads CD11c, MACS columnas MS, Separador MACS para el aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón de un solo de células en suspensión
2. Disociar el tejido pulmonar
- Enjuague el tejido en una placa de Petri que contiene PBS para eliminar los eritrocitos.
- La transferencia de un máximo de 450 mg de tejido pulmonar a un tubo que contiene 4,9 gentleMACS C ml de tampón HEPES.
- Añadir 100 l colagenasa solución D a una concentración final de 2 D. mg / ml de colagenasa
- Añadir 10 l DNasa solución que hasta los tejidos de 150 mg (concentración final de 40 U / ml DNasa I) o 20 l de DNasa I de 150-450 mg tejido pulmonar (concentración final de 80 I U / ml DNasa).
- Cierre bien el tubo C y adjuntarlo a la gentleMACS disociador. A continuación, ejecute el programa "m_lung_01".
- Incubar durante 30 min a 37 ° C con rotación automática o manualmente girando cada 5 minutos.
- De retorno de muestras a la disociador gentleMACS y ejecutar el programa "m_lung_02".
3. Filtración
- Preparar un tubo de 50 mL para la recolección de células filtrada mediante la sustitución de la tapa con un colador de malla celular 70 micras.
- Una vez que el segundo Programa de gentleMACS extremos, dependiendo de la distribución de material de la muestra en el tubo, puede centrifugar el tubo brevemente para recoger el material de la muestra en la parte inferior del tubo.
- Eliminar las células a través de la tapa del tabique sellado del tubo C con una punta de la pipeta adecuada 1000 l, y aplicarlos a las células colador.
- Lave el filtro celular con 5 ml de tampón HEPES a temperatura ambiente.
- Centrifugar las células a un sedimento en un tubo de 50 ml en 300xg durante 10 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en el volumen deseado de tampón PEB.
Parte 4: Resultados del representante:
Figura 1. Pulmón disociación con el disociador gentleMACS ™ resultó en 92% las células viables. Las células muertas se tiñeron con fluorescencia con yoduro de propidio (PI) (diagrama de puntos derecho, diagrama de puntos a la izquierda: no tinción PI).
Figura 2. Disociación de tejido pulmonar de ratón utilizando los resultados disociador gentleMACS en un alto porcentaje de leucocitos viables y células endoteliales. La derivada de una sola célula suspensiones fueron teñidas con CD45 y CD146-PE-FITC o CD31-FITC y analizadas por citometría de flujo.
Figura 3. Unicelulares suspensión derivadas de tejido pulmonar de ratón estaba manchada con CD11c-FITC y anti-mPDCA-1-APC para detectar ratón CD11c baja m-PDCA-1 + DCs plasmocitoide y células CD11c alta.
Figura 4. Enriquecimiento de las células dendríticas con MicroBeads CD11c, un separador de MiniMACS y dos columnas de la EM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este video, se introduce un nuevo método para la disociación de los tejidos de los pulmones del ratón. Se demuestra que una combinación de tratamiento mecánico y enzimático del tejido pulmonar producido un alto porcentaje de leucocitos viables y células endoteliales. En concreto, la desintegración mecánica de los tejidos se logró por el disociador gentleMACS. Los tubos de gentleMACS C incluyen un rotor - estator del sistema, que el tejido se disocia de una manera suave. El procedimiento es controlado por la configuración del programa del instrumento. Los ajustes se han optimizado para conseguir un alto rendimiento y viabilidad de las células. La derivada de una sola célula suspensiones fueron teñidas con CD45 y CD146-PE-FITC o CD31-FITC y analizadas por citometría de flujo para detectar leucocitos y células endoteliales. Las células dendríticas en la suspensión de una sola célula se tiñeron con CD11c-FITC y anti-mPDCA-1-APC. Además, las células dendríticas de un pulmón de ratón de un solo de células en suspensión se enriquecieron mediante la tecnología MACS. Células dendríticas fueron etiquetados utilizando magnética MicroBeads CD11c y separados mediante un separador MiniMACS y columnas MS 1,2 En general, la combinación de nuestro nuevo protocolo de disociación con clasificación de células magnética representa un método estandarizado para obtener tipos específicos de células del tejido pulmonar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores son empleados de Miltenyi Biotec GmbH, Alemania.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
