Summary
Ta avstånd celler från specifika vävnadstyper kräver särskild parametrar för vävnad agitation för att få en stor mängd livskraftiga, odlingsbara celler. Den Miltenyi gentleMACS dissociator optimerar denna uppgift med en enkel, praktisk protokoll. I denna publikation användning av denna apparat på lungvävnad förklaras.
Abstract
Beredningen av encelliga suspensioner från vävnader är en viktig förutsättning för många experiment i cellulära forskning. Processen att det skiljer hela organ kräver specifika parametrar för att få ett stort antal livskraftiga celler på ett reproducerbart sätt. Den gentleMACS Dissociator optimerar denna uppgift med en enkel, praktisk protokoll. Instrumentet innehåller förprogrammerade inställningar som är optimerade för effektiv men skonsam dissociation av olika vävnadstyper, inklusive mus lungorna. I denna publikation användningen av gentleMACS Dissociator på lungvävnad från möss kan påvisas.
Protocol
Att arbeta under sterila förhållanden, är det rekommenderat att utföra alla steg i ett laminärt flöde huva.
1. Material
- HEPES buffert: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mm KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
- Kollagenas D lösning: kollagenas D: 100 mg / ml (kollagenas D> 0,15 U / mg), i HEPES buffert
- DNas Jag lösning: 20.000 U / mL DNas jag
- PBS-buffert vid pH 7,2
- PEB buffert: 1 del BSA stamlösning i 20 delar autoMACS Sköljning lösning
- Vävnad: lung härrör från 6 / 7 veckor gammal vuxen hona BALB / C mus, fritt från angränsande organ.
- Tillval: CD11c mikrokulor, MACS MS kolumner, MACS Separator för isolering av dendritiska celler från mus lung encelliga fjädring
2. Ta avstånd lungvävnad
- Skölj vävnader i en petriskål med PBS för att avlägsna erytrocyter.
- Överlåta högst 450 mg lungvävnad till en gentleMACS C rör som innehåller 4,9 ml HEPES buffert.
- Tillsätt 100 mikroliter kollagenas D lösning till en slutlig koncentration om 2 mg / ml kollagenas D.
- Tillsätt 10 mikroliter DNas Jag lösning för upp till 150 mg vävnad (slutlig koncentration på 40 E / ml DNase I) eller 20 mikroliter DNas jag för 150-450 mg lungvävnad (slutlig koncentration på 80 U / mL DNase I).
- Tätt stänga C Tube och fäst den på gentleMACS Dissociator. Kör sedan programmet "m_lung_01".
- Inkubera 30 minuter vid 37 ° C med automatisk rotation eller manuellt vrida varje 5 min.
- Återgå prov till gentleMACS Dissociator och kör programmet "m_lung_02".
3. Filtrering
- Förbered en 50 ml rör för att samla in filtrerade celler genom att ersätta den gemensamma jordbrukspolitiken med en 70 ìm mesh cell sil.
- När den andra gentleMACS programmet avslutas, beroende på fördelningen av provmaterialet i röret, kan du centrifugera röret en kort stund för att samla in provet materialet på botten av röret.
- Ta bort celler genom membranet förseglade locket på C Tube med en passande 1000 l pipettspetsen och använda dem till cellen silen.
- Tvätta cellen silen med 5 ml HEPES buffert vid RT.
- Centrifugera cellerna till en pellet i en 50 ml rör på 300xg i 10 min.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i önskad volym av PEB buffert.
Del 4: representativa resultat:
Figur 1. Lung dissociation med gentleMACS ™ Dissociator resulterade i 92% livskraftiga celler. Döda celler fluorescerande färgades med propidiumjodid (PI) (höger dot plot, vänster dot plot: inga PI färgning).
Figur 2. Dissociation av mus lungvävnad med gentleMACS Dissociator resulterar i en hög andel av livskraftiga leukocyter och endotelceller. Den härledda encelliga suspensioner färgades med CD45-PE och CD146-FITC-eller CD31-FITC och analyseras med flödescytometri.
Figur 3. Single-cellsuspension från mus lungvävnad var fläckad med CD11c-FITC och Anti-mPDCA-1-APC för att upptäcka musen CD11c låg m-PDCA-1 + plasmacytoid DC samt CD11c hög celler.
Figur 4. Anrikning av dendritiska celler med CD11c mikrokulor, en MiniMACS Separator och två MS kolumner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video, introducerar vi en ny metod för dissociation av musen lungvävnad. Vi visar att en kombination av mekanisk och enzymatisk behandling av lungvävnad gav en hög andel lönsamma leukocyter och endotelceller. Närmare bestämt var den mekaniska upplösning av vävnad uppnås genom gentleMACS Dissociator. Den gentleMACS C Rör inkluderar en rotor - stator, som dissocierar vävnad i ett skonsamt sätt. Förfarandet styrs av programmets inställningar av instrumentet. Inställningarna har optimerats för att uppnå hög avkastning och lönsamhet för celler. Den härledda encelliga suspensioner färgades med CD45-PE och CD146-FITC-eller CD31-FITC och analyseras med flödescytometri för att upptäcka leukocyter och endotelceller. Dendritiska celler i encelliga fjädring färgades med CD11c-FITC och Anti-mPDCA-1-APC. Dessutom har dendritiska celler från en mus lung encelliga fjädring berikad med MACS teknik:. Dendritiska celler var magnetiskt märkta med CD11c mikrokulor och separeras med ett MiniMACS Separator och MS kolumner 1,2 I allmänhet en kombination av våra nya dissociation protokoll med magnetiska cellsortering representerar en standardiserad metod för att få specifika celltyper från lungvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna är anställda i Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
