Summary
Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für die Gewebe-Agitation um ein hohes Volumen an lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf das Lungengewebe erklärt.
Abstract
Die Herstellung von ein-Zellsuspensionen aus den Geweben ist eine wichtige Voraussetzung für viele Experimente in Zellforschung. Der Prozess der Dissoziation ganzen Organen erfordert spezifische Parameter, um eine hohe Anzahl von lebensfähigen Zellen in reproduzierbarer Weise zu erhalten. Die gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. Das Gerät enthält vorprogrammierte Einstellungen, die für die effiziente, aber schonende Dissoziation von einer Vielzahl von Gewebearten, darunter Mauslungen optimiert sind. In dieser Veröffentlichung wird die Nutzung des gentleMACS Dissociator auf das Lungengewebe von Mäusen abgeleitet wird demonstriert.
Protocol
Um Arbeit unter sterilen Bedingungen, ist es empfehlenswert, alle Schritte in einer Sterilbank durchgeführt.
1. Materialien
- HEPES-Puffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagenase D Lösung: Collagenase D: 100 mg / mL (Collagenase D> 0,15 U / mg), in HEPES-Puffer
- DNase I-Lösung: 20.000 U / mL DNase I
- PBS-Puffer bei pH 7,2
- PEB-Puffer: 1 Teil BSA-Stammlösung in 20 Teile autoMACS Mundspüllösung
- Tissue: Lunge von 6 / 7 Woche alt erwachsenen weiblichen BALB / C Maus, frei von angrenzenden Organen abgeleitet.
- Optional: CD11c MicroBeads, MACS MS Spalten, MACS Separator für die Isolierung von dendritischen Zellen aus der Maus Lunge Einzel-Zell-Suspension
2. Distanziert das Lungengewebe
- Das Gewebe spülen in eine Petrischale mit PBS auf die Erythrozyten zu entfernen.
- Transfer von maximal 450 mg Lungengewebe zu einer gentleMACS C Tube mit 4,9 ml HEPES-Puffer.
- 100 l Collagenase D-Lösung auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml Collagenase D.
- Add 10 l DNase I-Lösung für bis zu 150 mg Gewebe (Endkonzentration von 40 U / ml DNase I) oder 20 ul DNase I für 150-450 mg Lungengewebe (Endkonzentration von 80 U / ml DNase I).
- Verschließen Sie die C Rohr und befestigen Sie es auf die gentleMACS Dissociator. Dann starten Sie das Programm "m_lung_01".
- Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit automatischer Rotation oder manuelles Drehen alle 5 min.
- Return Probe auf die gentleMACS Dissociator und starten Sie das Programm "m_lung_02".
3. Filtration
- Bereiten Sie eine 50-ml-Tube zum Sammeln filtrierten Zellen durch das Ersetzen der Kappe mit 70 um Maschenweite Zellsieb.
- Sobald die zweite gentleMACS Programm endet in Abhängigkeit von der Verteilung des Probenmaterials in die Röhre, können Sie das Rohr kurz zentrifugieren, um das Probenmaterial am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Entfernen Sie die Zellen durch das Septum verschlossenen Deckel des C Rohr mit einem geeigneten 1000 ul Pipettenspitze und sie auf die Zelle Sieb.
- Waschen Sie die Zelle Sieb mit 5 ml HEPES-Puffer bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Zellen, um ein Pellet in einer 50 ml Tube bei 300xg für 10 min.
- Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in Ihrer gewünschten Volumen von PEB-Puffer.
Teil 4: Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Lung Dissoziation mit der gentleMACS ™ Dissociator führte in 92% lebensfähige Zellen. Tote Zellen wurden Fluoreszenz mit Propidiumiodid (PI) (;: keine PI-Färbung linken Dot-Plot rechten Dot-Plot) gefärbt.
Abbildung 2. Dissoziation von Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator Ergebnisse in einem hohen Prozentsatz lebensfähiger Leukozyten und Endothelzellen. Die abgeleiteten Einzel-Zellsuspensionen wurden mit CD45-PE und CD146-FITC oder CD31-FITC gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Abbildung 3. Single-Zellsuspension aus der Maus Lungengewebe abgeleitet wurde mit CD11c-FITC und Anti-mPDCA-1-APC Maus CD11c tief m-PDCA-1 + plasmazytoide DCs sowie CD11c hoch Zellen erkennen gefärbt.
Abbildung 4. Anreicherung von dendritischen Zellen mit CD11c MicroBeads, ein MiniMACS Separator und zwei MS Spalten.
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Discussion
In diesem Video stellen wir eine neue Methode für die Dissoziation von Maus Lungengewebe. Wir zeigen, dass eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Behandlung von Lungengewebe zu einem hohen Prozentsatz lebensfähiger Leukozyten und Endothel-Zellen ergab. Insbesondere wurde die mechanische Zerstörung des Gewebes durch die gentleMACS Dissociator erreicht. Die gentleMACS C Tubes umfassen einen Rotor - Stator-System, das distanziert Gewebe auf sanfte Weise. Das Verfahren wird durch die Programm-Einstellungen des Gerätes gesteuert. Die Einstellungen wurden optimiert, um hohe Ausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erreichen. Die abgeleiteten Einzel-Zellsuspensionen wurden mit CD45-PE und CD146-FITC oder CD31-FITC gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Leukozyten und Endothel-Zellen zu detektieren. Dendritische Zellen in der Einzel-Zell-Suspension wurden mit CD11c-FITC und Anti-mPDCA-1-APC gefärbt. Darüber hinaus wurden dendritische Zellen aus der Maus Lunge Einzel-Zell-Suspension angereichert mit MACS-Technologie:. Dendritischen Zellen wurden magnetisch markierte mit CD11c MicroBeads und trennte mit einem MiniMACS Separator und MS Spalten 1,2 Im Allgemeinen ist die Kombination aus unserem neuen Dissoziation Protokoll mit magnetic cell sorting stellt eine standardisierte Methode, um bestimmte Zelltypen aus Lungengewebe zu erhalten.
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Acknowledgments
Die Autoren sind Mitarbeiter von Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
