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Biology

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

doi: 10.3791/1266 Published: July 2, 2009

Summary

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

Abstract

A preparação de suspensões de uma única célula de tecidos é um requisito importante para muitas experiências em pesquisa celular. O processo de dissociação órgãos inteiros requer parâmetros específicos a fim de obter um elevado número de células viáveis ​​de forma reproduzível. O Dissociator gentleMACS otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. O instrumento contém ajustes pré-programados que são otimizados para a dissociação eficiente, mas suave de uma variedade de tipos de tecidos, incluindo pulmões mouse. Nesta publicação o uso do Dissociator gentleMACS no tecido pulmonar derivada de ratos é demonstrada.

Protocol

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Para trabalhar em condições estéreis, é recomendada a realização de todas as etapas em uma capela de fluxo laminar.

1. Materiais

  1. HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
  2. Colagenase solução D: D colagenase: 100 mg / mL (colagenase D> 0,15 U / mg) buffer, na HEPES
  3. DNase solução I: 20.000 U / mL DNase I
  4. Tampão PBS a pH 7,2
  5. PEB buffer: 1 parte da solução stock BSA em 20 partes autoMACS Solução lavagem
  6. Tecidos: pulmão derivado de 6 / 7 semanas de idade adulta feminina BALB / C mouse, livre de órgãos adjacentes.
  7. Opcional: microesferas CD11c, Colunas MACS MS, MACS Separador para o isolamento de células dendríticas a partir de suspensão de rato de pulmão de uma única célula

2. Dissociar o tecido pulmonar

  1. Enxaguar tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos.
  2. Transferir um máximo de 450 mg tecido pulmonar para um tubo contendo 4,9 C gentleMACS mL tampão HEPES.
  3. Adicionar 100 mL de solução de colagenase D para uma concentração final de 2 mg / ml de colagenase D.
  4. Adicionar 10 mL de solução DNase I para até 150 mg de tecido (concentração final de 40 U / ml DNase I) ou 20 mL DNase I para 150-450 mg tecido pulmonar (concentração final de 80 U / mL DNase I).
  5. Fechar o tubo firmemente C e anexá-lo para o Dissociator gentleMACS. Em seguida, executar o programa "m_lung_01".
  6. Incubar por 30 min a 37 ° C com rotação automática ou manualmente girando a cada 5 minutos.
  7. De recolha de amostras para o Dissociator gentleMACS e execute o programa "m_lung_02".

3. Filtração

  1. Prepare um tubo de 50 mL para a recolha de células filtradas, substituindo a tampa com uma peneira 70 mesh célula mM.
  2. Uma vez que o Programa gentleMACS segunda extremidades, dependendo da distribuição de material da amostra no tubo, você pode centrifugar o tubo rapidamente para recolher o material da amostra na parte inferior do tubo.
  3. Remover as células através da tampa do septo selada do tubo C usando um adequado mil ponteira mL e aplicá-las ao crivo da célula.
  4. Lavar o filtro de células com 5 ml tampão HEPES à temperatura ambiente.
  5. Centrifugar as células a uma bola em um tubo de 50 mL em 300xg por 10 min.
  6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em seu volume desejado de tampão PEB.

Parte 4: Resultados Representante:

Figura 1
Figura 1. Lung dissociação com o ™ gentleMACS Dissociator resultou em 92% de células viáveis. Células mortas foram fluorescente corados com iodeto de propídio (PI) (gráfico de pontos direita; gráfico de pontos à esquerda: nenhuma coloração PI).

Figura 2
Figura 2. Dissociação do mouse tecido pulmonar, utilizando os resultados Dissociator gentleMACS em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis ​​e células endoteliais. A derivada de uma única célula suspensões foram coradas com CD45-PE e CD146-FITC ou CD31-FITC e analisadas por citometria de fluxo.

Figura 2C
Figura 3. Único de células derivadas de suspensão tecido pulmonar do rato estava manchada de CD11c-FITC e Anti-mPDCA-1-APC para detectar rato CD11c baixa m-PDCA-1 + plasmocitóide DCs, bem como células CD11c alta.


Figura 4
Figura 4. Enriquecimento de células dendríticas usando microesferas CD11c, um separador MiniMACS e duas colunas MS.

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Discussion

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Neste vídeo, apresentamos um novo método para a dissociação do tecido pulmonar do rato. Nós mostramos que a combinação de tratamento mecânico e enzimático do tecido pulmonar resultou em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis ​​e células endoteliais. Especificamente, a desintegração mecânica do tecido foi obtido pela Dissociator gentleMACS. The Tubes gentleMACS C incluem um rotor - estator sistema, que dissocia o tecido de uma maneira suave. O procedimento é controlado por as configurações do programa do instrumento. As configurações foram otimizadas para atingir alto rendimento e viabilidade das células. A derivada de uma única célula suspensões foram coradas com CD45-PE e CD146-FITC ou CD31-FITC e analisadas por citometria de fluxo para detectar leucócitos e células endoteliais. Células dendríticas na suspensão de uma única célula foram coradas com CD11c-FITC e Anti-mPDCA-1-APC. Além disso, as células dendríticas a partir de uma suspensão do mouse único pulmão de células foram enriquecidas com Tecnologia MACS:. Células dendríticas foram magneticamente rotulados com microesferas de CD11c e separada utilizando um separador MiniMACS e colunas MS 1,2 Em geral, a combinação de sua nova dissociação protocolo com separação de células magnética representa um método padronizado para obter tipos específicos de células do tecido pulmonar.

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Acknowledgments

Os autores são funcionários da Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec Order No. 130-052-001 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026130-091-830 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-091-963 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-026 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi Biotec Order no. 130-091-610 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

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References

  1. Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
  2. Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).More

Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (29), e1266, doi:10.3791/1266 (2009).

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