Summary
Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.
Abstract
A preparação de suspensões de uma única célula de tecidos é um requisito importante para muitas experiências em pesquisa celular. O processo de dissociação órgãos inteiros requer parâmetros específicos a fim de obter um elevado número de células viáveis de forma reproduzível. O Dissociator gentleMACS otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. O instrumento contém ajustes pré-programados que são otimizados para a dissociação eficiente, mas suave de uma variedade de tipos de tecidos, incluindo pulmões mouse. Nesta publicação o uso do Dissociator gentleMACS no tecido pulmonar derivada de ratos é demonstrada.
Protocol
Para trabalhar em condições estéreis, é recomendada a realização de todas as etapas em uma capela de fluxo laminar.
1. Materiais
- HEPES buffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2)
- Colagenase solução D: D colagenase: 100 mg / mL (colagenase D> 0,15 U / mg) buffer, na HEPES
- DNase solução I: 20.000 U / mL DNase I
- Tampão PBS a pH 7,2
- PEB buffer: 1 parte da solução stock BSA em 20 partes autoMACS Solução lavagem
- Tecidos: pulmão derivado de 6 / 7 semanas de idade adulta feminina BALB / C mouse, livre de órgãos adjacentes.
- Opcional: microesferas CD11c, Colunas MACS MS, MACS Separador para o isolamento de células dendríticas a partir de suspensão de rato de pulmão de uma única célula
2. Dissociar o tecido pulmonar
- Enxaguar tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos.
- Transferir um máximo de 450 mg tecido pulmonar para um tubo contendo 4,9 C gentleMACS mL tampão HEPES.
- Adicionar 100 mL de solução de colagenase D para uma concentração final de 2 mg / ml de colagenase D.
- Adicionar 10 mL de solução DNase I para até 150 mg de tecido (concentração final de 40 U / ml DNase I) ou 20 mL DNase I para 150-450 mg tecido pulmonar (concentração final de 80 U / mL DNase I).
- Fechar o tubo firmemente C e anexá-lo para o Dissociator gentleMACS. Em seguida, executar o programa "m_lung_01".
- Incubar por 30 min a 37 ° C com rotação automática ou manualmente girando a cada 5 minutos.
- De recolha de amostras para o Dissociator gentleMACS e execute o programa "m_lung_02".
3. Filtração
- Prepare um tubo de 50 mL para a recolha de células filtradas, substituindo a tampa com uma peneira 70 mesh célula mM.
- Uma vez que o Programa gentleMACS segunda extremidades, dependendo da distribuição de material da amostra no tubo, você pode centrifugar o tubo rapidamente para recolher o material da amostra na parte inferior do tubo.
- Remover as células através da tampa do septo selada do tubo C usando um adequado mil ponteira mL e aplicá-las ao crivo da célula.
- Lavar o filtro de células com 5 ml tampão HEPES à temperatura ambiente.
- Centrifugar as células a uma bola em um tubo de 50 mL em 300xg por 10 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em seu volume desejado de tampão PEB.
Parte 4: Resultados Representante:
Figura 1. Lung dissociação com o ™ gentleMACS Dissociator resultou em 92% de células viáveis. Células mortas foram fluorescente corados com iodeto de propídio (PI) (gráfico de pontos direita; gráfico de pontos à esquerda: nenhuma coloração PI).
Figura 2. Dissociação do mouse tecido pulmonar, utilizando os resultados Dissociator gentleMACS em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis e células endoteliais. A derivada de uma única célula suspensões foram coradas com CD45-PE e CD146-FITC ou CD31-FITC e analisadas por citometria de fluxo.
Figura 3. Único de células derivadas de suspensão tecido pulmonar do rato estava manchada de CD11c-FITC e Anti-mPDCA-1-APC para detectar rato CD11c baixa m-PDCA-1 + plasmocitóide DCs, bem como células CD11c alta.
Figura 4. Enriquecimento de células dendríticas usando microesferas CD11c, um separador MiniMACS e duas colunas MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste vídeo, apresentamos um novo método para a dissociação do tecido pulmonar do rato. Nós mostramos que a combinação de tratamento mecânico e enzimático do tecido pulmonar resultou em uma alta porcentagem de leucócitos viáveis e células endoteliais. Especificamente, a desintegração mecânica do tecido foi obtido pela Dissociator gentleMACS. The Tubes gentleMACS C incluem um rotor - estator sistema, que dissocia o tecido de uma maneira suave. O procedimento é controlado por as configurações do programa do instrumento. As configurações foram otimizadas para atingir alto rendimento e viabilidade das células. A derivada de uma única célula suspensões foram coradas com CD45-PE e CD146-FITC ou CD31-FITC e analisadas por citometria de fluxo para detectar leucócitos e células endoteliais. Células dendríticas na suspensão de uma única célula foram coradas com CD11c-FITC e Anti-mPDCA-1-APC. Além disso, as células dendríticas a partir de uma suspensão do mouse único pulmão de células foram enriquecidas com Tecnologia MACS:. Células dendríticas foram magneticamente rotulados com microesferas de CD11c e separada utilizando um separador MiniMACS e colunas MS 1,2 Em geral, a combinação de sua nova dissociação protocolo com separação de células magnética representa um método padronizado para obter tipos específicos de células do tecido pulmonar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Os autores são funcionários da Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
