Summary
Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.
Abstract
Подготовка одноклеточных суспензий из тканей является важной предпосылкой для многих экспериментов в сотовых исследований. Процесс диссоциации целые органы требует специфических параметров, чтобы получить большое количество жизнеспособных клеток в воспроизводимым образом. GentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. Инструмент содержит предварительно запрограммированными настройками, которые оптимизированы для эффективной, но нежный диссоциации различных типов тканей, в том числе мыши легких. В этой публикации использование диссоциатор gentleMACS на легочную ткань производным от мышей показано.
Protocol
Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе.
1. Материалы
- HEPES буфера: 10 мМ HEPES-NaOH рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2)
- Коллагеназа D решение: Коллагеназа D: 100 мг / мл (коллагеназы D> 0,15 ЕД / мг), в HEPES буфере
- Я ДНКазы решение: 20000 Ед / мл ДНКазы I
- PBS буфере при рН 7,2
- PEB буфера: 1 часть маточного раствора BSA в 20 частях autoMACS Промывка решения
- Ткани: легкие производным от 6 / 7 недель старой взрослой самки BALB / C мышей, свободных от прилегающих органов.
- Дополнительно: CD11c микрошарики, MACS MS Столбцы MACS сепаратор для выделения дендритных клеток из мышиных легких одной клеточной суспензии
2. Диссоциирующего легочной ткани
- Промойте ткань в чашке Петри содержащие PBS для удаления эритроцитов.
- Передача максимум 450 мг ткани легкого для труб gentleMACS С, содержащего 4,9 мл HEPES буфера.
- Добавить 100 мкл Коллагеназа D решение конечной концентрации 2 мг / мл коллагеназы D.
- Добавьте 10 мкл ДНКазы я решение для до 150 мг ткани (конечная концентрация 40 ед / мл ДНКазы I) или 20 мкл ДНКазы я за 150-450 легочной ткани мг (конечная концентрация 80 ЕД / мл ДНКазы I).
- Плотно закрыть трубы С и прикрепить его на диссоциатор gentleMACS. Затем запустите программу "m_lung_01".
- Инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° C с автоматическим вращением или вручную поворотом каждые 5 мин.
- Вернуться образца диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_lung_02".
3. Фильтрация
- Подготовка 50 мл трубки для сбора отфильтрованных ячеек, заменив шапка с 70 мкм сито ячейки сетки.
- После второй программе gentleMACS концов, в зависимости от распределения материала образца в трубке, вы можете центрифуге трубки кратко собрать образцы материала в нижней части трубы.
- Удалить клеток через перегородку запечатанном крышкой трубки С помощью подходящего 1000 мкл кончика пипетки и применять их в ячейки фильтра.
- Вымойте ячейки фильтра с 5 мл HEPES буфера при комнатной температуре.
- Центрифуга клетки осадок в 50 мл трубки на 300xg течение 10 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в желаемом объеме буфера PEB.
Часть 4: Представитель Результаты:
Рисунок 1. Легкого диссоциации с gentleMACS ™ диссоциатор привело к 92% жизнеспособных клеток. Мертвые клетки флуоресцентно окрашенных пропидий йодида (PI) (право сюжет точку; левый участок точка: нет окрашивания PI).
Рисунок 2. Диссоциация мыши легочной ткани с использованием результатов gentleMACS диссоциатор в высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Производных одноклеточных суспензий окрашивали CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 3. Single-клеточной суспензии производным от мыши легочной ткани окрашивали CD11c-FITC и Анти-mPDCA-1-APC для обнаружения мыши CD11c низкий м-PDCA-1 + plasmacytoid контроллеров домена, а также высокой CD11c клеток.
Рисунок 4. Обогащение дендритных клеток с использованием CD11c микрошарики, сепаратор MiniMACS и два MS Столбцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео, мы вводим новый метод диссоциации легочной ткани мыши. Мы показали, что сочетание механических и ферментативных лечения легочной ткани дали высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. В частности, механические распада тканей было достигнуто за счет диссоциатор gentleMACS. GentleMACS C Трубы включают ротор - статор системы, которая отделяет ткани в смягченной форме. Процедура контролируется программой настройки инструмента. Параметры были оптимизированы для достижения высокой урожайности и жизнеспособности клеток. Производных одноклеточных суспензий окрашивали CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии для обнаружения лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Дендритных клеток в одной клеточной суспензии окрашивали CD11c-FITC и Анти-mPDCA-1-АПК. Кроме того, дендритные клетки мыши легких одной клеточной суспензии обогатились использованием MACS технологии:. Дендритные клетки были помечены использованием магнитно CD11c микрошарики и разделяются с помощью сепаратора MiniMACS и MS Столбцы 1,2 В целом, сочетание нашего нового диссоциации протокол с магнитной сортировки ячейка представляет стандартизованный метод для получения определенных типов клеток из ткани легкого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы являются сотрудниками Miltenyi Biotec GmbH, Германия.
Materials
References
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
