Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Published: July 7, 2009 doi: 10.3791/1267
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Miltenyi Biotec,GmbH

Summary

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب المعلمات محددة لaggitation الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi Dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. في هذا الكتاب هو شرح لاستخدام هذا الجهاز على أنسجة nerual.

Abstract

داخل الجهاز العصبي ، وقد وصفت المئات من أنواع الخلايا العصبية والدبقية. لكل نوع من أنواع معينة من الخلايا في الدماغ أو النخاع الشوكي لديه ذخيرة من جزيئات سطح الخلية ، أو المحددات الجزيئية ، والتي يمكن من خلالها التعرف عليه ، وتميزت. حاليا ، تحديد الخلية قوية وتقنيات الفصل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير للبروتين سطح مميزة. يمكن للDissociator gentleMACS ، عندما تستخدم في تركيبة مع التربسين أو غراء المستندة مجموعات تفارق وفعالية وبلطف فصل أنسجة المخ مع الحفاظ الحواتم المستضد ، والحد من فقدان الخلية. ويتحقق إعداد موحدة وحيدة الخلية الايقاف باستخدام أنابيب C ، وتحسين برامج gentleMACS مسبقا. ويمكن علاج تولد مرة واحدة ، وحيدة الخلية وحيدة النسيلة تقارن مع تعليق مثل مكافحة Prominin 1 - MicroBeads ، التي تحدد الأسلاف العصبية ، أو تنقيتها باستخدام مزيد من الخرز إزالة الميالين.

Protocol

على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود.

1. المواد

  • الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) (المكونات : الحل 1،2 و 3 و 4 ، والتخزين الاحتياطي)
  • قبل فصل فلاتر
  • (اختياري) الخرز إزالة المايلين
  • بيتا المركابتويثانول
  • gentleMACS Dissociator
  • C أنابيب
  • MACSmix الأنبوب الدوار
  • HBSS (ث / س)
  • HBSS (ث)
  1. إعداد الحلول التالية قبل بداية البروتوكول :
    1. هانكس "محلول الملح التخزين المؤقت دون كاتيونات الكالسيوم ثنائي التكافؤ 2 + أو Mg 2 + (HBSS (ث / س)
    2. HBSS ، ومعيار ، أي مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + (HBSS (ث)
  2. اعتمادا على حاتمة مستضد الفائدة في التطبيقات اللاحقة ، إما استخدام غراء المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) أو التربسين المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (T).
  3. إعداد الحلول التالية من أدوات الأنسجة العصبية التفكك :
    1. الحل 2 : إضافة بيتا المركابتويثانول إلى 0.067 ملي
    2. الحل 4 : مسحوق يذوب في 0.7 مل مخزن تخزين (المقدمة في المجموعة) ، ومزيج بلطف (لا الدوامة)
    3. ميكس انزيم 1 : 1.9 مل من محلول الماصة 2 و 50 ميكرولتر الحل 1 (كلاهما من المجموعة) في أنبوب جيم واحتضان لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه هي كافية لفصل 400 ملغ من أنسجة المخ.

2. عدم الربط بين الأنسجة العصبية

  1. تزن أنسجة المخ في أنبوب يحتوي على 1 مل HBSS (ث / س)
  2. نقل مخ الفأر في أنبوب C تحتوي على 1950 ميكرولتر من أنزيم ميكس محمى 1. (ملاحظة : كتب هذا البروتوكول ل≤ 400 ملغ ، ولكن يمكن تحجيمها وحدات التخزين حل لتستوعب ما يصل إلى 1600 ملغ من نسيج المخ في الأنبوب C)
  3. وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_01".
  4. احتضان مع التناوب (4 دورة في الدقيقة باستخدام أنبوب MACSmix الدوار) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_02".
  6. خلال الخطوة تعد تفارق 30 ميكرولتر من أنزيم ميكس 2 في 400 ملغ من النسيج من خلال مزج بلطف 20 ميكرولتر من محلول 3 و 10 ميكرولتر من الحل 4.
  7. إضافة أنزيم ميكس 2 إلى C أنبوب عبر الحاجز كاب مختومة والمزيج بلطف دون vortexing.
  8. احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
  9. وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج "m_brain_03".
  10. احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
  11. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع عينة في الجزء السفلي من الأنبوب.

3. تصفية

  1. اختيار مرشح كبيرة بما يكفي للسماح للمرور على خلايا الفائدة. على سبيل المثال ، خلايا بركينيي كبيرة جدا لتمر من خلال تصفية 30 ميكرون ، ولكن سوف Prominin - 1 + الخلايا.
  2. استخدام ماصة suitable1000 ميكرولتر لإزالة الخلايا تشكل أنبوب C من خلال كاب الحاجز مختومة وتطبيقه على تصفية ما قبل الفصل في أنبوب جمع 15 مل. (ملاحظة : لأحجام أكبر عينة استخدام أنبوب جمع 50 مل).
  3. غسل فلتر مع 10 مل من HBSS (ث).
  4. الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. Resuspend supernatent والمتوسطة في المخزن الخاص أو في الاختيار للتطبيقات اللاحقة.
  6. لإزالة الحطام الميلين ، واستخدام الخرز إزالة الميالين.

4. ممثل النتيجة : يرجى الاطلاع على الأرقام 1-3

الشكل 1
الرقم. (1) أدى تفكك المخ مع Dissociator gentleMACS في خلايا قابلة للحياة بنسبة 97 ٪ ، كما يظهر تحليل تدفق cytometric.

الشكل 2
الرقم. 2 صورة المجهر ضوء تشكيل خلية neurosphere بعد فرز المغناطيسي استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 بعد 7 أيام من زراعتها في MACS ® NeuroMedium تستكمل مع PLUS MACS B27 الملحق. وأعدت خلايا من مخ الفأر CD1 (P3) باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P).

الشكل 3.5
الرقم. 3 المايلين في الحطام وحيدة الخلية تعليق يضعف إلى حد كبير بمعزل عن الخلية ، وإزالة الأنقاض التي الخرز إزالة النخاعين المايلين الزيادات فصل الخلايا الكفاءة. لفصل MACS استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 ، وكان P22 مخ الفأر فصلها باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P). وكانت الخلايا من التعليق وحيدة الخلية تستخدم إما مباشرة للانفصال ، أو قدمت إلى استنفاد المايلين باستخدام الخرز إزالة الميالين. مقارنة عينات من دون الانفصال عن ومع إزالة النخاعين ، يدل على أن نقاء أعلى للعينات مع إزالة النخاعين السابقة.

Discussion

وDissociator gentleMACS يسهل إعداد موحدة وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة العصبية في نظام مغلق. الأنسجة العصبية هي الأمثل للحفاظ على أطقم التفكك الحواتم المستضد اللازمة لتطبيقات أخرى مثل وimmunostainings immunomagnetic فصل الخلية 1-5. في هذا البروتوكول نظهر التفكك طيف الأنزيمية للدماغ فأر باستخدام Dissociator gentleMACS والأنسجة العصبية التفكك كيت (P) ، مما أسفر في خلايا قابلة للحياة 97 ٪. 100 ملغ من غلة الأنسجة العصبية بين 6 و 5x10 1x10 7 خلايا ، اعتمادا على عمر النسيج المضيف. وقد تم عزل المستهدفة Prominin - 1 + الخلايا باستخدام مضاد للProminin - 1 MicroBeads واقتيد بعد ذلك إلى الثقافة. يظهر بروتوكول لتكون أكثر فعالية مع استخدام إضافية من الخرز إزالة المايلين عند العمل مع الأنسجة العصبية المشتقة من P7> الفئران.

Disclosures

الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
  2. Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  3. Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
  4. Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
  5. Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).

Tags

الأساسية البروتوكول ، علم الأعصاب ، العدد 29 ، زراعة الخلايا ، خلية التفكك ، العصبيه ، والماوس
جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune,… More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter