Summary
Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.
Abstract
Binnen het zenuwstelsel, hebben honderden neuronale en gliale celtypes beschreven. Elke specifieke celtype in de hersenen of het ruggenmerg heeft een repertoire van het celoppervlak moleculen of moleculaire determinanten, waardoor het kan worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Op dit moment, robuuste cel identificeren en de scheiding technologieën vereisen single-cell voorbereidingen worden gegenereerd, terwijl tegelijkertijd het beperken van celdood en vernietiging van karakteristieke oppervlakte-eiwit. De gentleMACS Dissociator, indien gebruikt in combinatie met trypsine of papaïne op basis van dissociatie kits, kan effectief en zachtjes distantiëren hersenweefsel met behoud van antigen epitopen en het beperken van cel-verlies. Gestandaardiseerde voorbereiding van de single-cell suspensies wordt gerealiseerd met behulp van C Buizen en geoptimaliseerd, vooraf ingestelde gentleMACS Programma's. Eenmaal gegenereerd, single-celsuspensies kunnen worden behandeld met monoklonale antilichaam zoals Anti-Prominin-1 microbolletjes, die neurale voorlopercellen te identificeren, of gezuiverd verder met Myeline verwijderen Beads.
Protocol
Om te werken onder steriele omstandigheden, is het raadzaam om alle stappen in een laminaire stroming kap uit te voeren.
1. Materialen
- Zenuwweefsel Dissociatie Kit (P) (Componenten: Oplossing 1,2, 3 en 4, Storage Buffer)
- Pre-Scheiding Filters
- (Optioneel) Myeline Removal Beads
- Beta-mercaptoethanol
- gentleMACS Dissociator
- C Buizen
- MACSmix Tube Rotator
- HBSS (w / o)
- HBSS (w)
- Bereid de volgende oplossingen voor het begin van het protocol:
- Gebufferde Salt Hanks 'oplossing zonder tweewaardige kationen Ca 2 + of Mg 2 + (HBSS (w / o)
- HBSS, standaard, dat wil zeggen met Ca 2 + en Mg 2 + (HBSS (w)
- Afhankelijk van het antigeen epitoop van belang in de volgende toepassingen, gebruikt u de Papaïne op basis van zenuwweefsel Dissociatie Kit (P) of het trypsine-based zenuwweefsel Dissociatie Kit (T).
- Bereid de volgende oplossingen uit de Neural Tissue Dissociatie Kit:
- Oplossing 2: voeg beta-mercapto-ethanol op 0,067 mM
- Oplossing 4: los poeder in 0,7 ml Storage Buffer (meegeleverd in de kit), meng (niet vortex)
- Enzym Mix 1: Pipetteer 1,9 ml Oplossing 2 en 50 ul Oplossing 1 (beide uit kit) in een C Tube en incubeer 10-15 minuten bij 37 ° C. Dit is voldoende om 400 mg van hersenweefsel dissociëren.
2. Dissociatie van de neurale weefsel
- Weeg hersenweefsel in een buisje met 1 ml HBSS (w / o)
- Overdracht hersenen van muizen in de C Tube met 1950 pi van voorverwarmde Enzyme Mix 1. (NB: dit protocol is geschreven voor ≤ 400 mg, maar volume van de oplossingen kan geschaald naar maximaal 1600 mg van hersenweefsel per C Tube zijn)
- Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_01".
- Incubeer met rotatie (4 min met behulp van een MACSmix Tube Rotator) gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_02".
- Tijdens de dissociatie stap voor te bereiden 30 ul van Enzyme Mix 2 per 400 mg van het weefsel door zachtjes mengen 20 ul van Solution 3 en 10 ul van Solution 4.
- Voeg Enzyme Mix 2 naar de C Tube via het septum afgesloten cap en meng voorzichtig zonder vortex.
- Incubeer de C Tube met rotatie gedurende 10 min bij 37 ° C in een incubator.
- Plaats de C-Tube op de gentleMACS Dissociator en start het programma "m_brain_03".
- Incubeer de C Tube met rotatie gedurende 10 min bij 37 ° C in een incubator.
- Centrifugeer kort aan het monster te verzamelen op de bodem van de buis.
3. Filtratie
- Selecteer een filter groot genoeg is om doorgang te laten de cellen van belang. Bijvoorbeeld, Purkinje cellen zijn te groot zijn om door een 30 urn filter, maar Prominin-1 + cellen.
- Gebruik een suitable1000 ul pipet om de cellen te verwijderen vormen de C buis door de septum-verzegelde dop en toepassen op de Pre-Separation filter op een 15 ml collectie buis. (NB: voor grotere steekproefomvang gebruik maken van een 50 ml collectie buis).
- Was het filter met 10 ml van HBSS (w).
- Centrifugeer de gefilterde cellen op 300 xg gedurende 10 min bij RT.
- Resuspendeer de supernatent in uw medium of buffer van de keuze voor latere aanvragen.
- Voor het verwijderen van myeline vuil, gebruik Myeline verwijderen Beads.
4. Vertegenwoordiger Resultaat: Zie Figuren 1-3
Figuur. 1 De hersenen dissociatie met de gentleMACS Dissociator resulteerde in 97% levensvatbare cellen, zoals flowcytometrische analyse laat zien.
Figuur. 2 licht microscoop beeld van neurosphere vorming na magnetische celsortering met behulp van anti-Prominin-1 microbolletjes na 7 dagen van de teelt in MACS ® NeuroMedium aangevuld met MACS Supplement B27 PLUS. Cellen werden bereid uit CD1 hersenen van muizen (P3) met de Neural Tissue Dissociation Kit (P).
Figuur. 3 Myeline puin in single-cell suspensies vermindert aanzienlijk celisolatie, en het verwijderen van myeline puin door Myeline verwijderen Kralen verhoogt de efficiëntie cel scheidingen. Voor MACS Scheidingen met behulp van anti-Prominin-1 microbolletjes, P22 hersenen van muizen werd gedissocieerd met behulp van de Neural Tissue Dissociation Kit (P). Cellen van de single-celsuspensie werden ofwel direct gebruikt voor de scheiding, of werden voorgelegd aan uitputting myeline met behulp van Myeline verwijderen Beads. Vergelijking van de scheiding van monsters zonder en met myeline verwijdering, toont aan dat de zuiverheid hoger is voor monsters met de vorige myeline verwijderen.
Discussion
De gentleMACS Dissociator vergemakkelijkt de gestandaardiseerde voorbereiding van de single-cell schorsingen van zenuwweefsel in een gesloten systeem. Zenuwweefsel Dissociatie Kits zijn geoptimaliseerd om antigeen epitopen die nodig is voor verdere toepassingen zoals immunostainings en immunomagnetische celscheiding 1-5 te behouden. In dit protocol laten we de zachte enzymatische dissociatie van de muis hersenen met behulp van de gentleMACS Dissociator en de Neural Tissue Dissociation Kit (P), wat in 97% levensvatbare cellen. 100 mg van zenuwweefsel rendementen tussen de 5x10 en 1x10 6 7 cellen, afhankelijk van de leeftijd van de gastheer weefsel. De beoogde Prominin-1 + cellen werden geïsoleerd met behulp van anti-Prominin-1 microbolletjes en vervolgens rekening mee cultuur. Het protocol is aangetoond dat het nog effectiever te zijn met het extra gebruik van myeline verwijderen kralen bij het werken met neurale weefsel afkomstig van muizen> P7.
Disclosures
De auteurs zijn medewerkers van Miltenyi Biotec GmbH, Duitsland.
Materials
References
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
