Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

doi: 10.3791/1267 Published: July 7, 2009

Summary

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

Abstract

בתוך מערכת העצבים, מאות סוגי תאים עצביים ועל גליה תוארו. כל סוג תא מסוים במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של פני השטח מולקולות התא, או גורמים המולקולרית, שבאמצעותה ניתן זוהו ואופיינו. נכון לעכשיו, זיהוי תאים חזקים טכנולוגיות הפרדה דורשים תא בודד ההכנות להיות שנוצר ובמקביל הגבלת מוות של תאים והרס של חלבון משטח אופייני. Dissociator gentleMACS, כאשר בשילוב עם טריפסין או papain מבוססי ערכות דיסוציאציה, יכול ביעילות ובעדינות לנתק את רקמת המוח תוך שמירה epitopes אנטיגן והגבלת אובדן התא. הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מושגת באמצעות צינורות C, אופטימיזציה, תוכניות מראש gentleMACS. לאחר שנוצר, תא בודד השעיות יכולים להיות מטופלים עם conjugates חד שבטיים כמו אנטי Prominin microbeads-1, אשר לזהות אבות עצביים, או מטוהרים נוסף באמצעות חרוזים המיאלין הסרת.

Protocol

כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית.

1. חומרים

  • רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P) (רכיבים: פתרון 1,2, 3 ו 4, מאגר אחסון)
  • טרום ההפרדה מסננים
  • (אופציונאלי) המיאלין חרוזים להסרת
  • בטא mercaptoethanol
  • gentleMACS Dissociator
  • C צינורות
  • MACSmix Rotator Tube
  • HBSS (w / o)
  • HBSS (w)
  1. הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול:
    1. הנקס "שנאגרו מלח פתרון ללא קטיונים divalent Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS (w / o)
    2. HBSS, סטנדרטי, כלומר עם Ca 2 + ו - Mg 2 + (HBSS (w)
  2. בהתאם epitope את האנטיגן עניין ביישומים הבאים, להשתמש או Papain מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (P) או טריפסין מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (T).
  3. הכן את הפתרונות הבאים מן הרקמה עצבית דיסוציאציה קיט:
    1. פתרון 2: להוסיף בטא mercaptoethanol מ"מ 0.067
    2. פתרון 4: לפזר אבקת הצפת 0.7 מ"ל אחסון (מסופק בערכה), לערבב בעדינות (לא מערבולת)
    3. אנזימים מערבבים 1: פתרון 1.9 מ"ל פיפטה 2 ו 50 פתרון μl 1 (הן ערכה) לתוך צינור C ו דגירה של 10-15 דקות על 37 ° C. זה מספיק כדי לנתק 400 מ"ג של רקמת המוח.

2. Dissociating הרקמה העצבית

  1. לשקול את רקמת המוח בתוך שפופרת המכילה 1 מ"ל HBSS (w / o)
  2. העברת העכבר המוח לתוך הצינור C המכיל 1950 μL של מיקס אנזימים שחומם מראש 1. (הערה: בפרוטוקול זה נכתב עבור 400 מ"ג ≤, אבל כרכים פתרון וניתן לשנותם כדי להכיל עד 1600 מ"ג של רקמת המוח לכל Tube C)
  3. מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_01".
  4. דגירה עם סיבוב (4 סל"ד באמצעות Rotator Tube MACSmix) במשך 15 דקות על 37 ° C.
  5. מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_02".
  6. במהלך השלב דיסוציאציה להכין 30 μl של אנזימים מערבבים 2 מ"ג לכל 400 ברקמת ידי ערבוב בעדינות 20 μl של פתרון 3 ו - 10 μl של פתרון 4.
  7. הוסף מערבבים אנזימים 2 עד התחתית C באמצעות כובע, מחצה אטום ומערבבים בעדינות מבלי vortexing.
  8. דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור.
  9. מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית "m_brain_03".
  10. דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור.
  11. צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בחלק התחתון של הצינור.

3. סינון

  1. בחר מסנן מספיק גדול כדי לאפשר מעבר לתאים של עניין. למשל, תאים פורקינג' הם גדולים מדי כדי לעבור דרך מסנן 30 מיקרומטר, אך Prominin-1 + תאים תהיה.
  2. השתמש פיפטה μl suitable1000 כדי להסיר את התאים בצורה Tube C באמצעות כובע, מחצה אטום ולהחיל אותו מסנן ההפרדה מראש על צינור איסוף 15 מ"ל. (הערה: עבור גודל מדגם גדול יותר להשתמש צינור איסוף 50 מ"ל).
  3. שטפו את המסנן עם 10 מ"ל של HBSS (w).
  4. צנטריפוגה התאים מסוננים על XG 300 דקות 10 ב RT.
  5. Resuspend supernatent בינוני או חיץ של בחירה עבור יישומים הבאים.
  6. כדי להסיר פסולת מיאלין, המיאלין הסרת להשתמש חרוזים.

4. תוצאות נציג: אנא ראו איורים 1-3

תאנה 1
איור. 1 דיסוציאציה המוח עם Dissociator gentleMACS הביא תאים קיימא 97%, כפי שמראה ניתוח תזרים cytometric.

תאנה 2
איור. 2 תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות neurosphere לאחר מיון התא מגנטי באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads לאחר 7 ימים של טיפוח MACS ® NeuroMedium בתוספת MACS B27 מוסף PLUS. תאים שהוכנו מהמוח CD1 העכבר (P3), תוך שימוש ברקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P).

תאנה 3.5
איור. 3 פסולת המיאלין של תא בודד המתלים פוגמת במידה ניכרת בידוד תא, סילוק פסולת המיאלין על ידי הסרת חרוזים המיאלין מגביר תא הפרדות יעילות. עבור הפרדות MACS באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads, P22 במוח העכבר היה ניתק באמצעות רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). תאים ההשעיה תא בודד היו גם להשתמש ישירות עבור ההפרדה, או הוגשו המיאלין דלדול באמצעות חרוזים המיאלין הסרת. השוואת דגימות ללא הפרדה עם הסרת המיאלין, מוכיח כי הטוהר גבוהה יותר עבור דגימות עם הסרת המיאלין הקודם.

Discussion

Dissociator gentleMACS מאפשר הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מרקמות עצביים במערכת סגורה. רקמה עצבית ערכות דיסוציאציה מותאמים לשמר epitopes אנטיגן הדרושים יישומים נוספים כמו immunostainings והפרדה תא immunomagnetic 1-5. בפרוטוקול זה אנו מראים ניתוק האנזימטית עדין של המוח באמצעות העכבר Dissociator gentleMACS ואת הרקמה העצבית דיסוציאציה Kit (P), מניב בתאים קיימא 97%. 100 מ"ג של רקמה עצבית התשואות בין 6 5x10 ו 1x10 7 תאים, בהתאם לגיל של רקמות המאכסן. ממוקד Prominin-1 + תאים בודדו באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads ונלקח לאחר מכן לתוך התרבות. הפרוטוקול מוצג להיות אפילו יותר יעילה עם שימוש נוסף של חרוזים המיאלין הסרת כשעובדים עם רקמה עצבית נגזר P7> עכברים.

Disclosures

הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
  2. Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  3. Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
  4. Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
  5. Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter