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Biology

माउस तंत्रिका ऊतक से सिंगल सेल निलंबन का सृजन

doi: 10.3791/1267 Published: July 7, 2009

Summary

विशिष्ट प्रकार के ऊतकों से अलग कोशिकाओं ऊतक aggitation के लिए विशिष्ट मानकों व्यवहार्य, कृषि कोशिकाओं की एक उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए की आवश्यकता है. Miltenyi gentleMACS Dissociator एक सरल, व्यावहारिक प्रोटोकॉल के साथ इस कार्य का अनुकूलन. इस प्रकाशन में nerual ऊतक पर इस उपकरण का उपयोग समझाया गया है.

Abstract

तंत्रिका तंत्र के भीतर neuronal और glial सेल प्रकार के सैकड़ों का वर्णन किया गया है. मस्तिष्क या स्पाइनल कॉर्ड में प्रत्येक विशिष्ट कक्ष प्रकार कोशिका की सतह अणु, या आणविक निर्धारकों, जिसके माध्यम से वह और पहचाना जा सकता है विशेषता के एक प्रदर्शनों की सूची है. वर्तमान में, मजबूत सेल पहचान और जुदाई प्रौद्योगिकियों एकल सेल की तैयारियाँ जबकि एक साथ सेल और विशेषता सतह प्रोटीन की मौत विनाश सीमित उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता होती है. gentleMACS Dissociator, जब trypsin या papain आधारित हदबंदी किट के साथ संयोजन में उपयोग किया है, और प्रभावी ढंग से और धीरे मस्तिष्क के ऊतकों को अलग कर देना जबकि प्रतिजन epitopes के संरक्षण और सेल हानि को सीमित कर सकते हैं. एकल कक्ष निलंबन के मानकीकृत तैयारी सी ट्यूब और अनुकूलित, प्रीसेट gentleMACS प्रोग्राम्स का उपयोग करने के लिए हासिल की है. एक बार उत्पन्न, एकल कक्ष निलंबन विरोधी Prominin 1 microbeads, जो तंत्रिका progenitors की पहचान, या आगे शुद्ध Myelin निकालना मोती का उपयोग तरह मोनोक्लोनल conjugates के साथ इलाज किया जा सकता है.

Protocol

बाँझ शर्तों के तहत काम करने के लिए, यह एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी चरणों का पालन करने के लिए सिफारिश की है.

1. माल

  • तंत्रिका ऊतक पृथक्करण (पी) किट (अवयव: समाधान 1,2, 3, और 4, भंडारण बफर)
  • पूर्व पृथक्करण फ़िल्टर
  • (वैकल्पिक) Myelin निकालना मोती
  • बीटा - mercaptoethanol
  • gentleMACS Dissociator
  • सी ट्यूबों
  • MACSmix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी
  • HBSS (w / ओ)
  • HBSS (w)
  1. पहले प्रोटोकॉल शुरुआत के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार:
    1. Buffered हैंक्स द्विसंयोजक फैटायनों बिना नमक समाधान 2 Ca + या + 2 (मिलीग्राम HBSS (w / ओ)
    2. HBSS, मानक, यानी 2 Ca के साथ + और ​​+ 2 (HBSS w (मिलीग्राम)
  2. बाद के अनुप्रयोगों में ब्याज की प्रतिजन मिलान के आधार पर, या तो papain आधारित तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट (पी) या trypsin आधारित तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट (टी) का उपयोग करें.
  3. तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट से निम्नलिखित समाधान तैयार:
    1. 2 समाधान: 0.067 मिमी बीटा mercaptoethanol जोड़ने
    2. 4 समाधान: 0.7 मिलीलीटर भंडारण बफर (किट में दिए गए) में पाउडर भंग, धीरे मिश्रण (भंवर नहीं है)
    3. एनजाइम मिक्स 1: 37 पर पिपेट 1.9 एमएल 2 और एक सी ट्यूब और 10-15 मिनट के लिए सेते में 50 μl एक समाधान (किट से दोनों) समाधान डिग्री सेल्सियस यह मस्तिष्क के ऊतकों के 400 मिलीग्राम को अलग कर देना पर्याप्त है.

2. तंत्रिका ऊतक अलग

  1. 1 मिलीलीटर HBSS (w / ओ) युक्त ट्यूब में मस्तिष्क के ऊतकों वजन
  2. सी preheated एनजाइम मिक्स 1 के 1950 μL युक्त ट्यूब में स्थानांतरण माउस मस्तिष्क. (नोट: इस प्रोटोकॉल ≤ 400 मिलीग्राम के लिए लिखा है, लेकिन समाधान मात्रा मस्तिष्क के ऊतकों के 1600 मिलीग्राम सी ट्यूब प्रति को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है है)
  3. GentleMACS Dissociator पर सी ट्यूब प्लेस और चलाने के कार्यक्रम "m_brain_01".
  4. 37 पर 15 मिनट के लिए रोटेशन (4 MACSmix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी का उपयोग rpm) के साथ सेते डिग्री सेल्सियस
  5. GentleMACS Dissociator पर सी ट्यूब प्लेस और चलाने के कार्यक्रम "m_brain_02".
  6. हदबंदी कदम के दौरान धीरे से 3 समाधान और समाधान के 4 10 μl के 20 μl मिश्रण से ऊतक के 400 मिलीग्राम प्रति एनजाइम 2 मिक्स के 30 μl तैयार.
  7. सी ट्यूब पट बंद टोपी के माध्यम से एनजाइम 2 मिक्स जोड़ें vortexing बिना धीरे मिश्रण.
  8. 10 मिनट के लिए रोटेशन के साथ 37 सी ट्यूब ° सी एक इनक्यूबेटर में सेते हैं.
  9. GentleMACS Dissociator पर सी ट्यूब प्लेस और चलाने के कार्यक्रम "m_brain_03".
  10. 10 मिनट के लिए रोटेशन के साथ 37 सी ट्यूब ° सी एक इनक्यूबेटर में सेते हैं.
  11. संक्षिप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे नमूना इकट्ठा.

3. छानने का काम

  1. एक फिल्टर बड़े पर्याप्त ब्याज की कोशिकाओं को पारित होने की अनुमति का चयन करें. उदाहरण के लिए, Purkinje कोशिकाओं को भी एक 30 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए बड़े हैं, लेकिन Prominin-1 + कोशिकाओं.
  2. Suitable1000 μl विंदुक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को हटाने के पट बंद टोपी के माध्यम से सी ट्यूब के रूप में और यह एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब पर पूर्व पृथक्करण फ़िल्टर लागू. (नोट: के लिए बड़ा नमूना आकार एक 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब का उपयोग करें).
  3. HBSS (डब्ल्यू) के 10 मिलीलीटर के साथ फिल्टर धो लें.
  4. आरटी से कम 10 मिनट के लिए 300 XG पर फ़िल्टर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  5. या बाद के अनुप्रयोगों के लिए अपने पसंद के बफर माध्यम में supernatent Resuspend.
  6. माइलिन मलबे को हटाने के लिए, Myelin निकालना मोती का उपयोग करें.

4. प्रतिनिधि नतीजे: कृपया आंकड़े 1-3 देखें

1 अंजीर
चित्रा. 1 gentleMACS Dissociator के साथ मस्तिष्क हदबंदी 97% व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चलता है के रूप में हुई.

2 अंजीर
चित्रा. 2 neurosphere गठन की लाइट माइक्रोस्कोप चित्र चुंबकीय सेल छँटाई के बाद एमएसीएस में खेती के 7 दिनों के बाद विरोधी Prominin-1 का उपयोग microbeads ® NeuroMedium एमएसीएस अनुपूरक B27-PLUS के साथ पूरक. कक्ष CD1 माउस (पी 3) मस्तिष्क तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट (पी) का उपयोग से तैयार किया गया.

3.5 अंजीर
चित्रा. 3 एकल कक्ष निलंबन में Myelin मलबे काफी सेल अलगाव impairs, और माइलिन मलबे के Myelin निकालना मोती द्वारा हटाने दक्षता सेल separations बढ़ जाती है. एमएसीएस विरोधी Prominin-1 microbeads का उपयोग कर Separations के लिए, P22 माउस मस्तिष्क तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट (पी) का उपयोग कर अलग किया गया था. एकल कक्ष निलंबन से कोशिकाओं या तो सीधे जुदाई के लिए इस्तेमाल किया गया, या रिक्तीकरण माइलिन Myelin निकालना मोती का उपयोग पेश थे. नमूनों से माइलिन हटाने के बिना और साथ जुदाई, तुलना दर्शाता है कि शुद्धता पिछले माइलिन हटाने के साथ नमूने के लिए अधिक है.

Discussion

gentleMACS Dissociator एक बंद व्यवस्था में तंत्रिका ऊतकों से मानकीकृत एकल कक्ष निलंबन की तैयारी की सुविधा है. तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट प्रतिजन immunostainings और immunomagnetic सेल 1-5 जुदाई की तरह आगे अनुप्रयोगों के लिए की जरूरत epitopes के संरक्षण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में हम माउस gentleMACS Dissociator और तंत्रिका ऊतक हदबंदी किट (पी) का उपयोग कर मस्तिष्क के कोमल एंजाइमी हदबंदी दिखाने के लिए, 97% की व्यवहार्य कोशिकाओं में उपज. 6 5x10 और 1x10 मेजबान ऊतक की उम्र के आधार पर 7 कोशिकाओं, तंत्रिका ऊतक के बीच पैदावार के 100 मिलीग्राम है. लक्षित Prominin 1 + कोशिकाओं विरोधी Prominin-1 microbeads का उपयोग कर अलग थे और बाद में संस्कृति में ले लिया. प्रोटोकॉल Myelin निकालना मोती के अतिरिक्त उपयोग के साथ और भी अधिक प्रभावी हो सकता है जब चूहों> P7 से व्युत्पन्न तंत्रिका ऊतक के साथ काम करने के लिए दिखाया गया है.

Disclosures

लेखकों Miltenyi बायोटेक GmbH, जर्मनी के कर्मचारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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References

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Cite this Article

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

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