Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi

doi: 10.3791/1267 Published: July 7, 2009

Summary

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku aggitation için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında, nerual doku bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Abstract

Sinir sistemi içinde, yüzlerce nöronal ve glial hücre tipleri tarif edilmiştir. , Beyin ya da omurilik her belirli bir hücre tipi, hücre yüzey molekülleri ya da moleküler belirleyiciler, tespit ve karakterize edilebilecek bir repertuara sahiptir. Şu anda, sağlam hücre tanımlama ve ayırma teknolojileri aynı karakteristik yüzey proteini hücre ölüm ve yıkım sınırlayan tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tripsin veya papain tabanlı disosiasyon kitleri ile birlikte kullanılan antijen epitoplar korunması ve hücre kaybını sınırlandırarak gentleMACS Dissociator, etkin ve beyin dokusu hafifçe ayrılabilir. Tek hücre süspansiyonları Standardize hazırlık C Tüpler ve optimize edilmiş, önceden belirlenmiş gentleMACS Programları kullanılarak elde edilir. Bir kere üretilen tek hücre süspansiyonları, sinir atalarıdır tanımlamak veya Miyelin Kaldırma Boncuk kullanarak daha saflaştırılmış Anti-Prominin-1 mikro, gibi monoklonal konjugatları ile tedavi edilebilir.

Protocol

Steril koşullar altında çalışmak için, bir laminer akış kaputun içindeki tüm adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

1. Malzemeler

  • Sinir Doku Ayrılma Kit (P) (Bileşenleri: Çözüm 1,2, 3 ve 4, Depolama Buffer)
  • Pre-Ayırma Filtreler
  • (Isteğe bağlı) Miyelin Kaldırma Boncuk
  • Beta-mercaptoethanol
  • gentleMACS Dissociator
  • C Tüpler
  • MACSmix Tüp Rotator
  • HBSS (w / o)
  • HBSS (w)
  1. Protokol başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
    1. Kalsiyum katyonları olmadan Hanks 'Tamponlu Tuz Çözeltisi Ca 2 + ve Mg 2 + (HBSS (w / o)
    2. HBSS, standart, yani Ca 2 + ve Mg 2 + (HBSS (w)
  2. Sonraki uygulamalarda ilgi antijen epitop bağlı, ya Papain-Sinir Doku Ayrılma Kit (P) veya tripsin tabanlı Sinir Doku Ayrılma Kiti (T) kullanın.
  3. Sinir Doku Ayrılma Kit aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
    1. Çözüm 2: 0,067 mM beta-mercaptoethanol eklemek
    2. Çözüm 4: 0.7 ml Depolama Buffer (kit) toz çözülür, yavaşça karıştırmayın (vorteks)
    3. Enzim Mix 1: C Boru ve 10-15 dakika boyunca inkübe pipetlenir 1.9 mL Çözüm 2 ve 50 ul Çözüm 1 (her iki kit) 37 ° C. Bu, beyin dokusu, 400 mg ayırmak yeterli olacaktır.

2. Sinir doku Dissociating

  1. 1 ml HBSS (w / o) içeren bir tüp içinde beyin dokusu tartılır
  2. Önceden ısıtılmış Enzim Mix 1 1950 mcL içeren C Tüp içine fare beyin aktarın. (NOT: Bu protokol ≤ 400 mg için yazılmıştır, ama çözüm hacimleri beyin dokusu 1600 mg C Tüp başına kadar ölçeklendirilebilir)
  3. C Tüp gentleMACS Dissociator üzerine yerleştirin ve programı "m_brain_01" çalıştırın.
  4. 37 15 dakika dönüş (MACSmix Tüp Rotator kullanarak 4 rpm) ile inkübe ° C.
  5. C Tüp gentleMACS Dissociator üzerine yerleştirin ve programı "m_brain_02" çalıştırın.
  6. Ayrışma adım sırasında 20 Çözüm 3 ve Çözüm 4 10 ul ul yavaşça karıştırılarak doku başına 400 mg Enzim Mix 2 30 ul hazırlar.
  7. Enzim Mix 2 septum mühürlü bir kap ile C Tüp ekleyin ve karıştırın olmadan hafifçe karıştırın.
  8. 37 ° C Tüp 10 dakika dönme ° C bir kuluçka inkübe edin.
  9. C Tüp gentleMACS Dissociator üzerine yerleştirin ve programı "m_brain_03" çalıştırın.
  10. 37 ° C Tüp 10 dakika dönme ° C bir kuluçka inkübe edin.
  11. Borunun alt kısmında örnek toplamak için kısaca santrifüjleyin.

3. Süzme

  1. Bir filtre yeterince büyük ilgi hücrelere geçmesine izin seçin. Örneğin, Purkinje hücreleri, 30 mikron filtre geçmek için çok büyük, ama Prominin-1 + hücreler.
  2. Hücreleri çıkarmak için bir suitable1000 ul pipet kullanın septum mühürlü bir kap aracılığıyla C Tüp formu ve 15 ml toplama tüpü Pre-Ayırma Filtre uygulamak. (NOT: daha büyük örneklem büyüklüğü 50 ml toplama tüpünün kullanımı için).
  3. 10 ml HBSS (w) ile filtre yıkayın.
  4. RT 10 dakika boyunca 300 xg'de süzülür hücreleri Santrifüj.
  5. Sonraki uygulamalar için orta ya da seçim tampon supernatent süspanse edin.
  6. Miyelin enkaz kaldırmak için, Miyelin Kaldırma Boncuk kullanın.

4. Temsilci Sonuç: Lütfen Rakamlar 1-3 bak

Şekil 1
Şekil. 1 gentleMACS Dissociator ile beyin ayrılma akım sitometri analizi gösterdiği gibi,% 97 canlı hücreleri sonuçlandı.

şekil 2
Şekil. (2) neurosphere oluşumu Işık mikroskop resim manyetik hücre sıralama sonra 7 gün sonra MACS olarak ekimi kullanarak ® Anti-Prominin-1 mikro NeuroMedium MACS Ek B27 PLUS ile desteklenebilir. Hücreler CD1 fare beyin Sinir Doku Ayrılma Kit (P) (P3) hazırlanmıştır.

Şekil 3.5
Şekil. Tek hücre süspansiyonları 3 Miyelin enkaz hücre izolasyonu önemli ölçüde bozar ve Miyelin Kaldırma Boncuk miyelin enkaz kaldırma verimliliği hücre ayırımlar artar . Anti-Prominin-1 mikro kullanarak MACS Ayrımları için P22 fare beyin Sinir Doku Ayrılma Kit (P) kullanarak ayrışmış oldu. Tek hücre süspansiyonu hücreleri doğrudan ayrılması için kullanılır, ya da Miyelin Kaldırma Boncuk kullanarak tükenmesi miyelin sunuldu. Miyelin çıkarmadan ve örnekleri ayırma karşılaştırma saflık önceki miyelin kaldırılması ile örnekler için daha yüksek olduğunu göstermektedir.

Discussion

GentleMACS Dissociator kapalı bir sistem içerisinde nöral dokuların tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık kolaylaştırır. Sinir Doku Ayrılma Kitleri immunostainings ve immunomagnetic hücre ayırma 1-5 gibi başka uygulamalar için gerekli antijen epitoplar korumak için optimize edilmiştir. Bu protokolde, biz% 97 canlı hücreler verimli gentleMACS Dissociator ve Sinir Doku Ayrılma Kit (P) kullanarak fare beyin nazik enzimatik ayrılma göstermektedir. 5x10 6 ve konakçı doku yaşına bağlı olarak 1x10 7 hücreleri arasındaki, sinir doku verimi 100 mg . Hedef Prominin-1 + hücreler Anti-Prominin-1 mikro kullanılarak izole edilmiş ve daha sonra kültürün içine alınmıştır. Protokol, farelerin> P7 türetilen sinir dokusu ile çalışırken Miyelin Kaldırma Boncuk ek kullanımı ile daha da etkili olduğu gösterilmiştir.

Disclosures

Yazarlar Miltenyi Biotec GmbH, Almanya çalışanları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
  2. Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  3. Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
  4. Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
  5. Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
Fare Sinir Doku Hücre Tek Cezalar Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter