Summary
嵌合と四分子の分離は、遺伝子分析のために必要です。
Abstract
単細胞緑藻
Protocol
パート1：配偶子形成のための菌株の調製
注：すべての操作は室温で実施すべきである。より高いまたはより低い温度では、受精卵発芽の速度に影響を与えると生存率に悪影響を及ぼす場合があります。
重要な考慮事項：交尾する菌株が確実に成長し、菌類や細菌を汚染の自由にされることが不可欠です。株は定期的に転送されていない場合、リッチな培地上で継代は、配偶子の世代の前にしてください。
- 交尾する菌株は、TAPのプレート（100 × 15 mm）を、プレートに1〜2株に転写されています。細胞は幅約1cmの集中ストリップで栽培する必要があります。
- 確実に成長している細胞の厚い層が存在するまで、TAPプレート上でインキュベートすると、中間の転送必要に応じて、継続すべきである。定期的な使用中の野生型株が数日とない通路のみがかかる場合があります一方、最近では継代されていない株は、一つの通路と1週間の合計が必要な場合があります。光に敏感な変異体はさらに時間が必要になる場合があります。
- 窒素欠乏していると配偶子形成を誘導し始めるN10の板、にTAPプレートからすべてのセルを転送します。彼らは、TAPのプレート上に存在していたのと同様、厚いスラブとしてセルを転送します。これは、細胞のその後のコレクションを容易にするでしょう。 N10で3日後、細胞は配偶子形成を受けるために準備されています。細胞分裂は、N10上で遅くなる、しかし、細胞は暗緑色のままにしてください。実行可能な接合体が得られないので汚染された菌株は破棄されるべきである。
パート2：嵌合
- 各菌株は、50 mL三角フラスコに移し、約2.5 mlの滅菌蒸留水に再懸濁されている。これは、どちらワイヤループまたは滅菌スティックを使用して行うことができます。重要なのは細胞がよくまとまって中断していないということです。水の正確な量は、目で正確に測ら細胞濃度は、それぞれの菌株に対してほぼ同じになるように調整する必要があります。
- 細胞は、細胞が運動性配偶子になるかを時間の間に、2時間に強い光（1.260μE / M 2 /秒 ）の下に攪拌されています。運動性は、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。配偶子が悪い泳いでいる場合、交配は非効率である可能性が高いです。しかし、さらに悪い運動性株は、低い周波数をかん合します。
- 次に、MT +とMT -配偶子の等しくないボリュームは、単一の50mlフラスコに結合されます。配偶子は、撹拌せずに強い光（1.260μE / M 2 /秒 ）の下に残されています。
- 交配は、光学顕微鏡下ですぐに確認することができます。配偶子のペアが急速に形成され、急速に移動する細胞は鞭毛で接合として表示されます。交配は非常に急速であることが表示されている場合、サンプルは接合子の世代のために30分-1時間以内に撮影してください。そうでない場合、これは省略可能ですが、交配は、それぞれの時間を確認することができます。接合体の最適な密度を与える時間は、十字架の間に大きく変化するので、1時間、2時間、3時間及び4時間後に配偶子、などを組み合わせた後、異なる時間に交配の混合物のアリコートを取るのがベストです。プレート3〜4箇所、これは、300μLのサンプルに、TAP - 3％ディフコ寒天60 × 15mmのプレートを転送することによって行われます。これは交配のペアを混乱させる可能性があるため、交配の混合物を撹拌しないように注意してください。ディフコ寒天は、それが低価格の寒天よりも少ない汚染物質を持っているため使用され、そしてそれは、顕微鏡下で受精卵を見ることが容易になります。
未使用の交配混合物を一晩フラスコのままになってしまうこと、そして交配の反応の質は、翌日には明らかであろう。交配が効率的であるときは、接合体は、フラスコの壁や底に付着すると媒体が明確に表示されます。フラスコのさえ攪拌は、受精卵を取り除くために、失敗します。混合物を合理的な勢いで興奮しているガラスに何もスティックは、その後、交配は非効率的だったか行われなかった場合。 - どのような表面の液体が吸収されるまで交配の混合物を含むTAP - Difco社のプレートは、半開きにふたで、無菌フード内で乾燥されています。接合胞子の成熟だけ暗闇の中で行われるので、プレートは一般的に、その後、ホイルに包んで、18時間光（700 NE / M 2 /秒）に残されます。日付と時刻の交配、交配株は板と箔の両方で書かれています。接合子発芽効率が徐々に下落したものの、プレートは、5〜7日間保存されており、長く保持することができます。
パート3：TETRAD解剖
- 栄養細胞は、メスのような退屈な刃を用いて交配混合物の乾燥スポットを、こすり落とすことがあります。ブレードは3％寒天にしっかりと付着される接合体の面積を、公開するために使用することができます。このステップは通常、受精卵は、次の朝までに発芽しているように、午後に行われますが、する2番目、植物分裂を受けていない8子孫を生む。 クラミドモナスの生物学者はすぐに彼らは栄養細胞よりも大きい、と黒い輪郭を与える厚い接合胞子壁を備えているため、顕微鏡下で受精卵を認識することを学ぶ。 Zygosporesは多くの場合黄色に見えますが、も少し緑があります。栄養細胞が容易に脇に移動している間、最も重要な文字は、彼らが寒天に固執するということです。プレートが過度に乾燥している場合は、このケースではないだろう。また、交配の混合物が非常に密である場合、受精卵は、個々の接合体の移動が困難または不可能になるマットを形成することがあります。適切な密度は、ステップ2.1で確立され、かつ迅速に経験して学習されます。
- ガラスの針は、受精卵を収集して四分子子孫を分離するために用意されています。これらは決裂することができる長い、細い糸を、生成するために小さな炎で3 mmのガラス棒を引いて準備されています。これらのテーパー端部の先端は、弱火で短時間加熱（例えばアルコールまたは燃焼マッチ）で、フックに平滑化したり曲げたりしている。彼らは非常に壊れやすいので、特に経験の浅いユーザーのために、、3つ以上のガラス針を準備します。
- 受精卵は、小さな山にガラス針を用いて3パーセントTAP -ディフコプレートに収集されます。接合体を含む寒天の二乗（最大0.5 cm 2）を鈍いメスを用いて形成され、摘出される。その後、寒天ブロックを15mm 1.5パーセントTAP -ディフコプレートに顔を下に配置され、そして受精卵を配布するため、プレートの上部から1.5 cm程度の水平線に沿って摺動。上部の水平線、および水平方向の約1.5 cmおよび0.5センチメートル垂直間隔を持つグリッドをプレートの後ろにエッチングされています。グリッドは、四分子の子孫を（グリッドも解剖の日をエッチングすることができます）を分離するためのガイドとして、次の日に使用されます。最後に、個々の受精卵は、プレート当たり約20〜30接合体で、それぞれの垂直線と上部の水平線の交点に移動されています。わずか12程度が解剖され、すべての接合子が発芽しない、といくつかは破裂する前に二回分裂しますが、その余分な受精卵が必要である。
- 配布後に誤って3％寒天プレートから転送された接合体、および栄養細胞は、クロロホルムの薄い（1-2 mm）の層を含むガラス皿上に30秒間反転板をさらすことによって殺される。プレートとクロロホルムとの間の距離は約5cmになります。あまりにも多くのクロロホルムが使用されている場合は距離が小さすぎるまたは大きすぎる場合、または、一つのリスクはどちらの接合子を殺す、または栄養細胞を殺すことではない。 zygosporesが選択性を確保するために、発芽のプレートで配布された後にクロロホルム処理を直ちに行う必要があります。
- 発芽はほとんどの菌株については16〜20時間がかかりますが、遺伝子型とし、受精卵の年齢とともに変化します。発芽のために、プレートは、低光（239 NE / M 2 /秒）の下に置かれている、または媒体に照らして組織でプレートを覆うことにより、淡色表示されます。
- 発芽受精卵は、それらの中の娘細胞と腫れたり、時々バースト細胞として顕微鏡下で識別することができます。接合胞子が破裂していない場合、発芽が発生した場合に、穏やかにガラス針で触れると、壁を破るだろう。娘細胞を穏やかに接合子下の格子点にドラッグされます。ガラス針の圧力によって寒天から放出液体培地を少量の細胞を捕捉し、針の後ろにこの"水たまり"をドラッグすることによってこれを行うのが最も簡単です。いずれかの受精卵ではなく二回分けている栄養細胞を解剖したことを"保険"の一形態では、離れてfour娘細胞から、接合胞子の壁の"皮膚"が残ることです。
- 目に見えるcloniesが、その後の分析のために選択できるまで、解剖子孫は、適切な条件下で栽培されています。プレートは、汚染のために毎日監視する必要があります。
注：植物二倍体の世代はここでは扱いませんが、本質的にどちらかの親系統の増殖をサポートしませんが、二倍体の成長（例えば、二つの異なるauxotropicマーカー）をサポートする培地上で交配の混合物をめっき伴います。プレートは、接合体の形成を避けるために、光に保管されています。
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Discussion
遺伝学的解析は、 クラミドモナスにシンプルですが、それは特定のテクニックは配偶子と別々の四分子の子孫を生成する必要があります。健康な株で、技術は容易に取得されます。いくつかの変異株と、それは芸術のより多くなり、読者は歴史的なメモや実用的なヒントのための最近発行されたクラミドモナスのソースブック第1巻を参照する必要があります。さらに、それは基本的なテーマに多くのバリエーションがあることに留意すべきは、配偶子形成を誘導するための方法から、接合子の分布と解剖のパターンに至るまで、上記の。最終的に、各研究者は彼らの快適ゾーンを見つける、または研究室固有のプロトコルに適応します。
特定の技術的な詳細は、上記の表明すべきである。特に、細胞が健康とすべての感染なしにする必要があります。それは、よく長時間交差されていない研究室に適応した系統がうまく交尾しないことが知られている、と水の品質も、配偶子形成に影響を与える可能性があります。
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Acknowledgments
このプロトコルは、研究所デBiologie物理Chimique、パリ、フランスでのフランシス=アンドレウォルマンの研究室で学んだ手法に基づいています。著者は、もともとクラミドモナス遺伝学的手法にDBSを導入したジャクリーンジラールBascou、に感謝の負債を負う。著者らの研究室でのクラミドモナスの研究は全米科学財団賞MCB - 0646350でサポートされている。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
