Summary
Paring en tetrade scheiding nodig zijn voor genetische analyse in
Abstract
De eencellige groene alg
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van de stammen voor gametogenese
Opmerking: Alle handelingen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Hogere of lagere temperaturen hebben invloed op de snelheid van de zygote kiemen en kan negatieve invloed hebben op levensvatbaarheid.
Belangrijke overweging: Het is essentieel dat de stammen worden gedekt robuuste groeien en zijn vrij van besmettelijke schimmels of bacteriën. Als de stammen niet op regelmatige wijze overgedragen, moeten passage op rijk medium voorafgaan generatie van gameten.
- Stammen worden gedekt worden overgebracht naar TAP platen (100 × 15 mm), 1-2 stammen per plaat. De cellen moeten worden gekweekt in een geconcentreerde strip ongeveer 1 cm in de breedte.
- Incubatie op TAP borden moeten blijven tot er een dikke laag van robuust-groeiende cellen aanwezig is, met tussentijdse transfers indien nodig. Stammen die niet onlangs zijn gepasseerd kunnen een passage en een totaal van 1 week, terwijl de wild-type stammen die regelmatig gebruik kan slechts een paar dagen en geen passages. Mutanten die lichtgevoelige wellicht meer tijd nodig.
- Breng alle cellen van het TAP platen aan N10 platen, die deficiënt zijn voor stikstof en zal beginnen te gametogenese induceren. Overdracht van de cellen als een dikke plaat, zoveel als ze aanwezig waren op de TAP-plaat. Dit zal de daaropvolgende verzameling van de cellen. Na 3 dagen op de N10, worden de cellen bereid om gametogenese ondergaan. Celdeling zal langzaam op de N10, maar cellen moeten donker groen blijven. Besmette stammen moeten worden weggegooid als levensvatbare zygoten zullen niet worden verkregen.
Deel 2: Mating
- Elke stam is overgebracht in een 50 ml Erlenmeyer hermetisch en geresuspendeerd in ongeveer 2,5 ml steriel gedistilleerd water. Dit kan worden gedaan hetzij met behulp van een draad lus of een steriele stok, wat belangrijk is, is dat de cellen goed zijn opgehangen en niet in groepjes. Het exacte volume van het water dient te worden aangepast, zodat de cel concentratie, zoals gemeten door het oog, is ongeveer hetzelfde voor elke stam.
- Cellen worden onrustig bij fel licht (1.260 μ E / m 2 / sec) gedurende 2 uur, gedurende welke tijd de cellen zullen worden beweeglijke gameten. Beweeglijkheid moeten worden gecontroleerd onder een lichtmicroscoop. Als de gameten slecht zwemmen, paring is waarschijnlijk inefficiënt. Toch zal zelfs slecht beweeglijke stammen mate een verminderde frequentie.
- Vervolgens gelijke volumes mt + en MT-gameten worden gecombineerd in een enkele 50 ml kolf. Gameten worden gelaten bij fel licht (1.260 μ E / m 2 / sec) zonder agitatie.
- Paring kan direct worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop. Paren van gameten vorm snel en wordt weergegeven als snel bewegende cellen zich op de flagellen. Als dekking blijkt te zijn extreem snelle, moeten regelmatig monsters worden genomen binnen 30 min -1 uur voor het genereren van zygoten. Zo niet, dan kan dekking worden gecontroleerd elk uur, maar dit is optioneel. Sinds keer waardoor de optimale dichtheid van zygoten zal sterk variëren tussen de kruizen, is het het beste om aliquots van de dekking mengsel te nemen op verschillende momenten na het combineren van gameten, bijvoorbeeld na 1 uur, 2 uur, 3 uur en 4 uur. Dit wordt gedaan door de overdracht van 300 il monsters aan TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm platen; 3-4 spots per plaat. Wees voorzichtig dat u de paring mengsel roeren, dit kan verstoren paring paren. Difco agar wordt gebruikt omdat het minder verontreinigingen dan lager geprijsde agars, en het zal gemakkelijker zijn om zygoten te zien onder de microscoop.
De ongebruikte paren mengsel kan worden achtergelaten in de kolf 's nachts, en de kwaliteit van de dekking reactie zal duidelijk zijn de volgende dag. Tijdens de paring efficiënt is, zal de zygoten hechten aan de wand of bodem van de kolf en het medium zal er helder. Zelfs agitatie van de kolf zullen voldoen aan de zygoten verjagen. Als er niets kleeft aan het glas als het mengsel wordt geschud met een redelijke kracht, dan is de paring was inefficiënt of niet heeft plaatsgevonden. - De TAP-Difco platen met paring mengsel worden gedroogd in een steriele kap, met de deksels op een kier, tot elk oppervlak vloeistof is geabsorbeerd. De platen zijn meestal nog in het licht (700 NE / m 2 / sec) voor 18 uur, daarna verpakt in folie, omdat zygospore rijping zal alleen plaatsvinden in het donker. De stammen gekruist, paring tijd en datum zijn geschreven op zowel de platen en de folie. Platen zijn opgeslagen 5 tot 7 dagen en kunnen langer bewaard worden, hoewel zygote kieming efficiëntie daalt geleidelijk.
Deel 3: Viertal Dissection
- Vegetatieve cellen moet worden afgeschraapt gedroogde plekken van de paring mengsel met behulp van een bot mes, zoals een scalpel. Het blad kan worden gebruikt om een gebied van zygoten, die strak zal houden aan de 3% agar bloot te leggen. Deze stap gebeurt meestal in de middag, zodat de zygoten ontkiemd zijn door de volgende ochtend, maar hebben niet ondergaan een seconde, vegetatieve divisie die zoudenopbrengst acht nakomelingen. Chlamydomonas biologen snel leren te herkennen zygoten onder de microscoop, omdat ze groter zijn dan vegetatieve cellen, en zijn voorzien van een dikke zygospore muur die een zwarte rand geeft. Zygospores lijken vaak geel, maar kan ook een beetje groen. Het belangrijkste personage is dat zij zich aan agar, terwijl de vegetatieve cellen zijn gemakkelijk opzij verplaatst. Echter, als de platen al te droog zal dit niet het geval. Ook, indien de paring mengsel was te dicht, kan zygoten vormen een mat waardoor de overdracht van individuele zygoten moeilijk of onmogelijk. Juiste dichtheid zijn gevestigd in stap 2.1, en zal snel te leren met ervaring.
- Glazen naalden zijn voorbereid voor het verzamelen van zygoten en het scheiden van tetrade nageslacht. Deze worden bereid door te trekken 3 mm glazen staven in een kleine vlam op een lange, dunne draad, die kan worden afgebroken te genereren. De toppen van deze taps toelopende uiteinden zijn gladgestreken of gebogen in haken, door korte verhitting in een lage vlam (bijv. alcohol of een brandende lucifer). Bereid drie of meer glazen naalden, want ze breken vrij gemakkelijk, vooral voor onervaren gebruikers.
- Zygoten zijn verzameld op de 3% TAP-Difco plaat met een glazen naald in een kleine stapel. Een vierkant van agar (tot 0,5 cm 2) met de zygoten is gevormd en weggesneden met behulp van een scalpel saai. Daarna wordt de agar blok gelegd naar beneden op een 15 mm 1.5% TAP-Difco plaat, en gleed langs een horizontale lijn ongeveer 1,5 cm van de bovenkant van de plaat, om de zygoten te verdelen. De bovenste horizontale lijn, en een grid met ongeveer 1,5 cm en 0,5 cm horizontale verticale afstand worden geëtst in de achterkant van de platen. Het raster wordt gebruikt de volgende dag als een leidraad voor het scheiden van het viertal nageslacht (het rooster kan ook worden geëtst op de dag van dissectie). Tot slot zijn individuele zygoten te verplaatsen naar de snijpunten van de bovenste horizontale lijnen met elke verticale lijn, met ongeveer 20-30 zygoten per plaat. Hoewel slechts 12 of zo zal worden ontleed, niet elke zygote ontkiemt, en sommigen zullen twee keer verdelen vóór het barsten, worden dus extra zygoten nodig is.
- Na het verdelen van de zygoten, en vegetatieve cellen die per ongeluk zijn overgedragen van de 3% agarplaat worden gedood door het blootstellen van de omgekeerde plaat gedurende 30 seconden via een glazen schaal met daarin een dunne (1-2 mm) laag van chloroform. De afstand tussen de plaat en chloroform moet ongeveer 5 cm. Als er te veel chloroform wordt gebruikt, of als de afstand te klein of groot, een risico of het doden van de zygoten, of niet het doden van de vegetatieve cellen. De chloroform behandeling moet onmiddellijk worden gedaan nadat de zygospores zijn verdeeld over de kieming plaat, om de selectiviteit te garanderen.
- Kieming duurt 16-20 uur voor de meeste stammen, maar zal variëren met genotype en met de leeftijd van de zygoten. Voor de kieming, worden de platen onder weinig licht (239 NE / m 2 / sec), of in middelgrote licht gedimd door het bedekken van de plaat met een tissue.
- Gekiemde zygoten kunnen worden geïdentificeerd onder de microscoop als gezwollen of soms barsten cellen met dochter cellen binnen hen. Als de zygospore nog niet verbroken, zal zachtjes aanraken met een glazen naald breken de muur als kieming heeft plaatsgevonden. Dochter cellen worden voorzichtig gesleept om het raster punten onder de zygote. Het is het makkelijkst om dit te doen door het vastleggen van de cel in een kleine hoeveelheid vloeibaar medium vrijkomt uit de agar door de druk van het glas naald, en slepen deze "plas" achter de naald. Een vorm van "verzekering" dat men een zygote en niet een vegetatieve cel die twee keer heeft verdeeld ontleed, is dat, afgezien van de vier dochter cellen, zal de "huid" van de zygospore muur blijven.
- De nakomelingen ontleed worden geteeld onder de juiste omstandigheden tot zichtbaar clonies kan worden opgehaald voor verdere analyse. Platen moet dagelijks worden gecontroleerd op besmetting.
Let op: Het genereren van vegetatieve diploïden is hier niet behandeld, maar in wezen gaat om plating de paring mengsel op medium dat niet de groei van een van beide ouders stam, maar zal de groei van de diploïde (bijv. twee verschillende auxotropic markers) te ondersteunen. Platen zijn bewaard in het licht van de vorming van zygoten te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetische analyse is eenvoudig in Chlamydomonas, maar het vereist specifieke technieken voor het genereren van gameten en aparte tetrade nageslacht. Met een gezonde stammen, zijn de technieken gemakkelijk verworven. Bij sommige mutante stammen, wordt het meer een kunst, en lezers moeten Volume 1 refereren aan de onlangs gepubliceerde Chlamydomonas bronnenboek voor historische notities en praktische tips. Bovendien moet worden opgemerkt dat er vele variaties op het basisthema hierboven beschreven, variërend van de methode voor het induceren van gametogenese, om het patroon van zygote distributie en dissectie. Uiteindelijk is elke onderzoeker vindt hun comfort zone, of past zich aan aan het laboratorium-specifieke protocollen.
Bepaalde technische details hierboven vermeld, moet worden herhaald. In het bijzonder moeten de cellen gezond zijn en zonder een infectie. Het is bekend dat in het laboratorium-aangepaste stammen die niet zijn overschreden gedurende langere tijd niet goed mate en kwaliteit van het water kan ook van invloed gametogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit protocol is gebaseerd op technieken geleerd in het laboratorium van Francis-Andre Wollman aan het Institut de Biologie Fysisch-Chimique, Parijs, Frankrijk. De auteurs danken een schuld van dankbaarheid aan Jacqueline Girard-Bascou, die oorspronkelijk DBS geïntroduceerd om Chlamydomonas genetische technieken. Chlamydomonas onderzoek in het auteurs 'laboratorium wordt ondersteund door de National Science Foundation Award MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
