Summary
הזדווגות והפרדה הטטרדה נדרשים לניתוח גנטי
Abstract
Unicellular אצה ירוקה
Protocol
חלק 1: הכנת זנים עבור gametogenesis
הערה: כל המניפולציות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר. טמפרטורות גבוהות או נמוכות ישפיע על מהירות של נביטה הזיגוטה ועלול להשפיע לרעה על יכולת הקיום.
שיקול חשוב: זה חיוני כי הזנים להיות הזדווגו גדלים וחסונה הם ללא זיהום פטריות או חיידקים. אם זנים לא הועברו באופן קבוע, מעבר על מדיום עשיר צריך להקדים דור של גמטות.
- זנים להיות הזדווגו מועברים על גבי צלחות TAP (100 × 15 מ"מ), 1-2 זנים לכל צלחת. התאים צריכים להיות בוגרים ברצועה מרוכז על 1 ס"מ רוחב.
- דגירה על צלחות TAP צריך להמשיך עד שכבה עבה של וחסונה גידול תאים קיים, עם העברות ביניים במידת הצורך. זנים שלא היה passaged לאחרונה עשויים לדרוש מעבר וכן סך של שבוע 1, בעוד wild-type זנים בשימוש רגיל יכול לקחת רק כמה ימים ולא מעברים. מוטציות כי הם רגישים לאור עשויה לדרוש זמן נוסף.
- העברת כל התאים מהצלחות הברז צלחות N10, אשר חסרים עבור חנקן יתחילו לגרום gametogenesis. העברת התאים כמו פרוסה עבה, כמה שהם היו נוכחים על הצלחת TAP. זה יקל אוסף הבאים של התאים. אחרי 3 ימים על N10, התאים מוכנים לעבור gametogenesis. חלוקת התא תהיה איטית על N10, לעומת זאת תאים צריך להישאר בצבע ירוק כהה. כל הזנים מזוהמים אמור להיות מושלך כמו zygotes קיימא לא תושג.
חלק 2: הזדווגות
- כל זן מועבר לתוך בקבוק erlenmeyer 50 מ"ל ו resuspended במים כ -2.5 מ"ל סטרילי מזוקקים. ניתן לעשות זאת גם באמצעות לולאה חוט או מקל סטרילי, מה שחשוב הוא כי התאים מושעים טוב ולא גושים. הנפח המדויק של המים צריך להיות מותאם כך ריכוז התא, נמדד לפי העין, הוא בערך אותו דבר עבור כל זן.
- תאים הם נסערים תחת אור חזק (1.260 E μ / m 2 / sec) למשך 2 שעות, שבמהלכן התאים יהפכו הגמטות ניעתי. תנועתיות צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ אור. אם הגמטות הם שוחים גרוע, ההזדווגות עשוי להיות יעיל. עם זאת, אפילו גרוע זנים ניעתי יהיה בן זוג בתדירות מופחתת.
- בשלב הבא, כרכים שווה של הר + ו-MT-הגמטות משולבים לתוך בקבוק אחד 50 מ"ל. הגמטות נותרים תחת אור חזק (1.260 E μ / m 2 / sec) ללא תסיסה.
- הזדווגות ניתן לבדוק מיד תחת מיקרוסקופ אור. זוגות של הגמטות צורה במהירות, יופיע התאים נע במהירות הצטרף ב שוטונים. אם הזיווג נראה מהיר מאוד, יש לקחת דגימות בתוך שעות 30 דקות -1 עבור הדור של zygotes. אם לא, הזדווגות ניתן לבדוק בכל שעה, אם כי זו היא אופציונלית. מאז פעמים נותן את צפיפות אופטימלי של zygotes ישתנו נרחב בין צלבים, עדיף לקחת aliquots של התערובת ההזדווגות בזמנים שונים לאחר שילוב גמטות, למשל לאחר 1 שעה, 2 שעות, 3 שעות ו - 4 שעות. הדבר נעשה על ידי העברת 300 דגימות μL לברז-3% אגר Difco 60 × 15 צלחות מ"מ; 3-4 נקודות לכל צלחת. היזהר שלא להתסיס את תערובת הזדווגות מכיוון שהדבר עלול לשבש זוגות מזדווגים. אגר Difco משמש כי יש מזהמים פחות במחיר נמוך agars, וזה יהיה יותר קל לראות zygotes מתחת למיקרוסקופ.
התערובת ההזדווגות בשימוש ניתן להשאיר את הבקבוק בלילה, ואיכות התגובה ההזדווגות יהיה ברור למחרת. לאחר ההזדווגות הוא יעיל, zygotes תדבק לקיר או התחתון של הבקבוק ובינוניים יופיעו ברור. גם תסיסה של הבקבוק ייכשל כדי לסלק את zygotes. אם מקלות שום הזכוכית כאשר התערובת הוא נסער בעוצמה סבירה, אז הזיווג היה לא יעיל או לא התקיימה. - TAP-Difco צלחות המכילות תערובת ההזדווגות הם מיובשים במנדף סטרילי, עם מכסים פתוחה, עד כל נוזל משטח נקלטה. הצלחות נותרים בדרך כלל לאור (700 NE / m 2 / sec) עבור 18 שעות, אז עטוף בנייר כסף, שכן התבגרות zygospore תתבצע רק בחושך. זנים חצתה, הזדווגות השעה והתאריך נכתבים על שתי צלחות את נייר הכסף. פלטות מאוחסנות 5 עד 7 ימים והוא יכול להישמר זמן רב יותר, למרות היעילות יורדת בהדרגה הזיגוטה נביטה.
חלק 3: Dissection הטטרדה
- בתאי צמח יש לגרד נקודות מיובש של תערובת הזדווגות באמצעות סכין קהה, כמו אזמל. הלהב יכול לשמש כדי לחשוף שטח של zygotes, אשר מקל בחוזקה אגר 3%. צעד זה נעשה בדרך כלל בשעות אחר הצהריים, כך zygotes יש מונבטים על ידי למחרת בבוקר, אבל לא עברו חלוקה השני, צמח אשרתשואה 8 צאצאים. ביולוגים Chlamydomonas במהירות ללמוד לזהות zygotes תחת המיקרוסקופ, כיוון שהם גדולים יותר מאשר התאים הצמחיים, והם כוללים קיר zygospore סמיך אשר נותן קו מתאר שחור. Zygospores לעתים קרובות מופיעים צהוב אבל יכול להיות גם קצת ירוק. הדמות החשובה ביותר היא שהם לדבוק אגר, בעוד התאים הצמחיים מועברים בקלות הצידה. עם זאת, אם הצלחות הם יבשים מדי זה לא יהיה המקרה. כמו כן, אם את התערובת ההזדווגות היה צפוף מדי, עלול להיווצר zygotes מחצלת שיאפשרו העברת zygotes אדם קשה או בלתי אפשרי. צפיפות מתאים מבוססים בשלב 2.1, ויהיה למדו מהר עם ניסיון.
- מחטים זכוכית מוכנים לאיסוף zygotes הפרדת צאצאים הטטרדה. אלה מוכנים על ידי משיכת מוטות זכוכית 3 מ"מ אש קטנה כדי ליצור חוטים ארוכים, דקים, אשר יכול להיות שבור. טיפים אלה מסתיים קוני הם החליקו או כפופות לתוך ווים, על ידי חימום קצר אש נמוכה (למשל אלכוהול או גפרור בוער). הכן 3 או יותר מחטים זכוכית, שכן הם לשבור בקלות יחסית, במיוחד עבור משתמשים לא מנוסים.
- Zygotes נאספים על הצלחת סטפס Difco 3% באמצעות מחט זכוכית לערימה קטנה. ריבוע של אגר (עד 0.5 ס"מ 2) המכיל את zygotes נוצר ו נכרת באמצעות אזמל קהה. ואז, לחסום את אגר ממוקם עם הפנים כלפי מטה על צלחת 15 1.5% סטפס Difco מ"מ, והחליק לאורך קו אופקי של כ -1.5 ס"מ מהחלק העליון של הצלחת, כדי לפזר את zygotes. הקו האופקי העליון, רשת עם כ 1.5 ס"מ 0.5 ריווח אופקי אנכי ס"מ חקוקות לחלק האחורי של הצלחות. הרשת תשמש למחרת כמדריך הפרדת צאצאים הטטרדה (רשת יכול להיות גם חרוט יום דיסקציה). לבסוף, zygotes בודדים לעבור בצמתים של קווים אופקיים העליון עם כל קו אנכי, עם כ 20-30 zygotes לכל צלחת. אמנם רק 12 או כך יהיה גזור, לא הזיגוטה כל germinates, וכמה תחלק פעמיים לפני שהם מתפוצצים, zygotes תוספת כך נחוצים.
- לאחר הפצת zygotes, ותאי צמח שהועברו בטעות צלחת אגר 3% נהרגים על ידי חשיפת צלחת הפוכה למשך 30 שניות על צלחת זכוכית המכילה שכבה דקה (1-2 מ"מ) של כלורופורם. המרחק בין הצלחת כלורופורם צריך להיות בערך 5 ס"מ. אם כלורופורם משמש יותר מדי, או אם המרחק קטן מדי או גדול, אחד הסיכונים או להרוג את zygotes, או לא להרוג את התאים הצמחיים. הטיפול כלורופורם חייב להיעשות מיד לאחר zygospores הופצו על הצלחת נביטה, כדי להבטיח סלקטיביות.
- נביטה לוקח 16-20 שעות עבור רוב זני, אבל ישתנו עם גנוטיפ עם גיל zygotes. עבור נביטה, צלחות ממוקמים באור נמוך (239 NE / m 2 / sec), או באור מעומעם בינוני על ידי כיסוי צלחת עם נייר.
- Zygotes מונבטים ניתן לזהות תחת מיקרוסקופ כמו תאים נפוחים או פרץ לפעמים עם לתאי הבת בתוכם. אם zygospore לא מקרע, נוגעת בעדינות עם מחט זכוכית תשבור את הקיר אם התרחשה נביטה. לתאי הבת הם גררו בעדינות לנקודות רשת מתחת הזיגוטה. היא הקלה ביותר לעשות זאת על ידי לכידת התא כמות קטנה של נוזל בינוני שוחרר מבית אגר על ידי לחץ של המחט זכוכית, גרירת הזה "שלולית" מאחורי המחט. צורה אחת של "ביטוח" כי יש גזור זיגוטה ולא תא צמח, כי יש לחלק פעמיים, כי מלבד התאים בת ארבע, "עור" של הקיר zygospore יישאר.
- הצאצאים גזור מגודלים בתנאים המתאימים עד clonies לעין יכול להיות נטל לניתוח שלאחר מכן. צלחות יש לעקוב מדי יום זיהום.
הערה: דור diploids צמח שאינו מכוסה כאן, אבל בעצם כרוך ציפוי את התערובת על הזדווגות בינוני אשר לא לתמוך בצמיחה של מתח או של ההורים, אלא לתמוך בצמיחה של דיפלואידי (למשל auxotropic שני סמנים שונים). פלטות נשמרים האור, כדי למנוע היווצרות של zygotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנליזה גנטית פשוטה Chlamydomonas, אבל זה דורש טכניקות מסוים כדי לייצר גמטות והצאצאים הטטרדה נפרד. עם זנים בריא, טכניקות נרכשות בקלות. עם כמה זנים מוטנטים, הוא הופך להיות יותר אמנות, וקוראים צריך להפנות כרך 1 של Sourcebook Chlamydomonas לאחרונה פרסם הערות היסטוריות רמזים מעשית. בנוסף, ראוי לציין כי יש וריאציות רבות על הנושא הבסיסי שתואר לעיל, החל בשיטה של גרימת gametogenesis, לדפוס של חלוקת הזיגוטה ו לנתיחה. בסופו של דבר, כל חוקר מוצא לאזור הנוחות שלהם, או מסתגל ספציפית מעבדה פרוטוקולים.
פרטים טכניים מסוימים שהוזכרו לעיל, יש חזר. בפרט, התאים חייבים להיות בריאים ללא זיהום כלשהו. זה ידוע היטב כי מעבדה המותאמות זנים אשר לא חצה במשך תקופות ארוכות לא יכול להזדווג היטב, איכות המים עשויה להשפיע גם על gametogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרוטוקול זה מבוסס על הטכניקות שנלמדו במעבדה של פרנסיס, אנדרה וולמן על צרפת Institut de Biologie פיסיקלי Chimique, פריז. המחברים חבים חוב של הכרת תודה ז'קלין Girard-Bascou, אשר במקור הציג DBS טכניקות Chlamydomonas גנטית. Chlamydomonas מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע פרס MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
