Summary
संभोग और tetrad जुदाई आनुवांशिक विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं
Abstract
कोशिकीय हरी alga की
Protocol
भाग 1: gametogenesis के लिए उपभेदों की तैयारी
नोट: सभी जोड़तोड़ कमरे के तापमान पर बाहर किया जाना चाहिए. उच्च या कम तापमान युग्मनज अंकुरण की गति को प्रभावित और प्रतिकूल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है.
महत्वपूर्ण विचार: यह आवश्यक है कि उपभेदों के लिए mated robustly बढ़ रहे हैं और कवक या बैक्टीरिया contaminating के लिए स्वतंत्र हैं. यदि उपभेदों नियमित रूप से स्थानांतरित नहीं किया गया है, अमीर माध्यम पर बीतने gametes की पीढ़ी पूर्व में होना चाहिए.
- के लिए mated खींच नल (100 × 15 मिमी) प्लेट, थाली प्रति 1-2 उपभेदों पर स्थानांतरित कर रहे हैं. कक्ष चौड़ाई में 1 सेमी के बारे में एक केंद्रित पट्टी में हो जाना चाहिए.
- नल प्लेटों पर ऊष्मायन तक robustly बढ़ कोशिकाओं की एक मोटी परत मौजूद है, यदि आवश्यक मध्यवर्ती स्थानान्तरण के साथ जारी रखना चाहिए. खींच कि हाल ही में passaged नहीं किया गया है एक मार्ग और एक सप्ताह के कुल आवश्यकता होती है, जबकि कुछ दिन और कोई मार्ग नियमित रूप से उपयोग में जंगली प्रकार उपभेदों ही लग सकता है हो सकता है. म्यूटेंट है कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील कर रहे हैं अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है.
- N10 प्लेटें, जो नाइट्रोजन के लिए कमी है और gametogenesis प्रेरित करने के लिए शुरू हो जाएगा नल प्लेटों से सभी कोशिकाओं स्थानांतरण. एक मोटी पटिया के रूप में कोशिकाओं स्थानांतरण, जितना वे नल प्लेट पर उपस्थित थे. यह कोशिकाओं के बाद के संग्रह की सुविधा होगी. N10 पर 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं को gametogenesis से गुजरना करने के लिए तैयार हैं. सेल विभाजन N10 पर धीमी गति से किया जाएगा, लेकिन कोशिकाओं गहरे हरे रंग रहना चाहिए. कोई दूषित उपभेदों व्यवहार्य zygotes के रूप में प्राप्त किया जा नहीं होगा त्याग किया जाना चाहिए.
भाग 2: संभोग
- प्रत्येक तनाव एक 50 मिलीलीटर erlenmeyer फ्लास्क में स्थानांतरित कर रहा है और लगभग 2.5 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल में resuspended. यह या तो एक तार पाश या एक बाँझ छड़ी का उपयोग किया जा सकता है है, महत्वपूर्ण बात यह है कि कोशिकाओं को और अच्छी तरह से निलंबित कर दिया है clumps में नहीं है. पानी की सही मात्रा समायोजित किया जा सेल एकाग्रता के रूप में आंखों से लगाया, ताकि प्रत्येक तनाव के लिए में उसी के बारे में है चाहिए.
- कक्ष मजबूत प्रकाश (1.260 μ ई / 2 मीटर / सेक) के तहत 2 घंटे के लिए उत्तेजित कर रहे हैं, जो समय के दौरान कोशिकाओं चलता - फिरता gametes हो जाएगा. गतिशीलता एक रोशनी खुर्दबीन के तहत जाँच की जानी चाहिए. यदि gametes खराब तैर रहे हैं, संभोग के अक्षम होने की संभावना है. हालांकि, भी खराब चलता - फिरता उपभेदों एक कम आवृत्ति दोस्त होगा.
- अगले, के बराबर मात्रा लाख टन + और mt-gametes एक एकल 50 मिलीलीटर फ्लास्क में संयुक्त रहे हैं. Gametes मजबूत प्रकाश (1.260 μ ई / 2 मीटर / सेक) के तहत आंदोलन के बिना छोड़ दिया जाता है.
- संभोग रोशनी खुर्दबीन के तहत तुरंत जाँच कर सकते हैं. Gametes के जोड़े तेजी प्रपत्र, और के रूप में तेजी से आगे बढ़ कोशिकाओं flagella में शामिल हो गए दिखाई देगा. यदि संभोग के लिए बहुत तेजी से प्रतीत होता है, नमूने zygotes की पीढ़ी के लिए 30 मिनट -1 घंटा के भीतर लिया होना चाहिए. यदि नहीं, तो संभोग हर घंटे जाँच किया जा सकता है, हालांकि यह वैकल्पिक है. Zygotes के इष्टतम घनत्व देने के बाद से बार पार के बीच व्यापक रूप से भिन्न होगी, यह सबसे अच्छा 1 घंटा, 2 बजे, 3 बजे और 4 बजे के बाद gametes, उदाहरण के संयोजन के बाद के अलग अलग समय पर संभोग के मिश्रण की aliquots ले रहा है. प्लेट प्रति 3-4 स्थानों, यह 300 μL करने के लिए नल-3% Difco अगर 60 × 15 मिमी प्लेटें नमूने स्थानांतरित द्वारा किया जाता है. संभोग मिश्रण नहीं आंदोलन के रूप में इस संभोग जोड़े को बाधित कर सकते हैं सावधान रहो. Difco अगर प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह कम कीमत agars की तुलना में कम contaminants के है, और यह आसान हो सकता है खुर्दबीन के नीचे zygotes देखेंगे.
अप्रयुक्त संभोग मिश्रण फ्लास्क में छोड़ा जा सकता है रात भर, और संभोग प्रतिक्रिया की गुणवत्ता स्पष्ट अगले दिन होगा. जब संभोग के कुशल है, zygotes या कुप्पी की दीवार के नीचे करने के लिए पालन करना और मध्यम स्पष्ट दिखाई देगा. यहां तक कि कुप्पी के आंदोलन zygotes बेदखल करने के लिए असफल हो जायेगी. यदि कांच जब मिश्रण उचित उत्साह के साथ उत्तेजित है के लिए कुछ भी नहीं चिपक जाती है, तो संभोग अक्षम किया गया था या जगह ले नहीं. - नल Difco संभोग मिश्रण युक्त प्लेटें एक बाँझ हुड में सूख रहे हैं, अधखुला lids के साथ, जब तक किसी भी सतह तरल अवशोषित कर दिया गया है. प्लेटें आम तौर पर 18 घंटे के लिए प्रकाश (700 NE / 2 मीटर / सेक) में छोड़ दिया जाता है, फिर पन्नी में लपेटा, zygospore परिपक्वता के बाद से ही अंधेरे में जगह ले जाएगा. उपभेदों को पार कर, समय और तारीख संभोग दोनों प्लेटें और पन्नी पर लिखा जाता है. प्लेट्स संग्रहीत 5 से 7 दिनों के हैं और अब रखा जा सकता है, हालांकि युग्मनज अंकुरण क्षमता उत्तरोत्तर गिरावट आती है.
भाग 3: Tetrad विच्छेदन
- वनस्पति कोशिकाओं बंद scraped एक स्केलपेल के रूप में संभोग के मिश्रण के सूखे धब्बे, एक सुस्त ब्लेड का उपयोग किया जाना चाहिए. ब्लेड zygotes के एक क्षेत्र, जो कसकर 3% अगर करने के लिए छड़ी जाएगा बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस कदम आमतौर पर दोपहर में किया जाता है, ताकि अगली सुबह zygotes द्वारा अंकुरित है, लेकिन एक दूसरे, वनस्पति विभाग है जो होता आया नहीं8 संतान उपज Chlamydomonas जीव जल्दी खुर्दबीन के नीचे zygotes पहचान, क्योंकि वे वनस्पति कोशिकाओं की तुलना में बड़े होते हैं, और एक मोटी zygospore दीवार है जो एक काले रंग की रूपरेखा देता है सुविधा सीखना. Zygospores अक्सर पीले रंग दिखाई देते हैं, लेकिन यह भी कुछ हद तक हरी हो सकता है. सबसे महत्वपूर्ण चरित्र है कि वे अगर करने के लिए छड़ी है, जबकि वनस्पति कोशिकाओं आसानी से स्थानांतरित कर रहे हैं अलग है. हालांकि, प्लेटें अगर पीढ़ी सूख रहे हैं इस मामले में नहीं होगा. इसके अलावा, अगर संभोग मिश्रण बहुत घना था, zygotes एक चटाई जो व्यक्ति zygotes के हस्तांतरण मुश्किल या असंभव कर देगा फार्म का हो सकता है. उपयुक्त घनत्व 2.1 चरण में स्थापित कर रहे हैं, और जल्दी से अनुभव के साथ रहना सीख जाएगा.
- ग्लास सुइयों zygotes एकत्र करने और tetrad संतान को अलग करने के लिए तैयार हैं. ये एक छोटी सी लौ में 3 मिमी कांच की छड़ खींच करने के लिए एक लंबे, पतले धागे, जो टूट किया जा सकता है है उत्पन्न द्वारा तैयार कर रहे हैं. इन पतला समाप्त होता है के सुझावों या smoothed तुला हुक में एक कम लौ (जैसे शराब या एक जलती हुई मैच) में संक्षिप्त हीटिंग द्वारा. 3 या उससे अधिक गिलास सुई तैयार है, क्योंकि वे काफी आसानी से तोड़ अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए विशेष रूप से,.
- Zygotes 3% नल Difco एक छोटे से ढेर में एक गिलास सुई का उपयोग कर प्लेट पर इकट्ठे हुए हैं. अगर के एक वर्ग (0.5 2 सेमी) zygotes युक्त गठन किया है और एक सुस्त स्केलपेल का उपयोग excised . फिर, अगर ब्लॉक का चेहरा रखा जाता है नीचे एक 15 मिमी 1.5% नल Difco थाली पर, और प्लेट के ऊपर से 1.5 सेमी के बारे में एक क्षैतिज रेखा के साथ गिरावट, zygotes वितरित. शीर्ष क्षैतिज रेखा, और लगभग 1.5 सेमी क्षैतिज और 0.5 सेमी ऊर्ध्वाधर अंतरालन के साथ एक ग्रिड प्लेटों के पीछे में etched हैं. ग्रिड अगले दिन tetrad संतान (ग्रिड भी विच्छेदन के दिन etched जा सकता है) को अलग करने के लिए एक गाइड के रूप में में इस्तेमाल किया जा जाएगा. अंत में, व्यक्तिगत zygotes प्रत्येक खड़ी रेखा के साथ शीर्ष क्षैतिज लाइनों के चौराहों को स्थानांतरित कर रहे हैं प्लेट प्रति 20-30 के बारे zygotes के साथ. हालांकि केवल 12 या तो germinates हर युग्मनज है, dissected किया जाएगा और कुछ फोड़ से पहले दो बार विभाजन होगा, तो अतिरिक्त zygotes की जरूरत है.
- वितरण के बाद zygotes, और वनस्पति कोशिकाओं है कि गलती से 3% अगर थाली से स्थानांतरित किया गया है क्लोरोफॉर्म की एक पतली परत (1-2 मिमी) से युक्त एक गिलास पकवान से अधिक 30 सेकंड के लिए उल्टे थाली उजागर द्वारा मारे गए हैं. प्लेट और क्लोरोफॉर्म के बीच की दूरी के बारे में 5 सेमी होना चाहिए. अगर बहुत ज्यादा क्लोरोफॉर्म प्रयोग किया जाता है, या अगर दूरी भी छोटे या महान है, एक जोखिम या तो zygotes हत्या, या वनस्पति कोशिकाओं की हत्या नहीं. क्लोरोफॉर्म इलाज तुरंत किया जाना चाहिए zygospores बाद अंकुरण थाली पर वितरित किया गया है, चयनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए.
- अंकुरण सबसे उपभेदों के लिए 16-20 घंटे लगते हैं, लेकिन जीनोटाइप के साथ और zygotes साल की उम्र के साथ अलग अलग होंगे. अंकुरण के लिए, प्लेटें कम प्रकाश (239 NE / 2 मीटर / सेक) के तहत रखा जाता है, या मध्यम प्रकाश में एक ऊतक के साथ कवर प्लेट द्वारा मंद.
- अंकुरित zygotes बेटी कोशिकाओं के साथ उन्हें अंदर सूजन या कभी कभी फट कोशिकाओं के रूप में खुर्दबीन के नीचे पहचाना जा सकता है है. यदि zygospore नहीं उठी है, धीरे से एक गिलास सुई के साथ छू दीवार तोड़ने अगर अंकुरण हुआ है. बेटी कोशिकाओं धीरे ग्रिड अंक नीचे युग्मनज घसीटा हैं. यह आसान है तरल मध्यम गिलास सुई के दबाव से अगर से जारी की एक छोटी राशि में सेल पर कब्जा, और सुई के पीछे इस "पोखर" खींच द्वारा इस. "बीमा" है कि एक और एक वनस्पति कोशिका विभाजित किया गया है कि दो बार नहीं युग्मनज dissected है, के एक फार्म है कि चार बेटी कोशिकाओं से अलग है, zygospore दीवार के "त्वचा" रहेगा.
- dissected संतान उचित शर्तों के तहत बड़े हो रहे हैं जब तक दिखाई clonies बाद के विश्लेषण के लिए उठाया जा सकता है है. प्लेट्स संदूषण के लिए दैनिक निगरानी करनी चाहिए.
नोट: यहाँ वनस्पति diploids की पीढ़ी कवर नहीं है, लेकिन मूलतः माध्यम है जो या तो माता पिता के तनाव के विकास का समर्थन नहीं करेंगे पर संभोग मिश्रण चढ़ाना शामिल है, लेकिन द्विगुणित (जैसे दो अलग auxotropic मार्करों) के विकास का समर्थन करेगा. प्लेट्स zygotes के गठन से बचने के प्रकाश में रखा जाता है.
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Discussion
जेनेटिक विश्लेषण Chlamydomonas में सरल है, लेकिन यह gametes और अलग tetrad संतान उत्पन्न करने के लिए विशेष तकनीक की आवश्यकता है. स्वस्थ उपभेदों के साथ, तकनीक आसानी से हासिल कर ली हैं. कुछ उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ, यह एक कला का अधिक हो जाता है, और पाठकों को ऐतिहासिक नोट्स और व्यावहारिक संकेत के लिए हाल ही में प्रकाशित Chlamydomonas सोर्सबुक की मात्रा 1 उल्लेख करना चाहिए. इसके अलावा, यह नोट किया जाए कि मूल विषय पर कई रूपों ऊपर वर्णित है, उत्प्रेरण gametogenesis के लिए विधि से लेकर युग्मनज वितरण और विच्छेदन के पैटर्न के लिए कर रहे हैं चाहिए. अंत में, प्रत्येक अनुसंधानकर्ता अपनी सुविधा क्षेत्र पाता, या प्रयोगशाला विशिष्ट - प्रोटोकॉल के लिए adapts.
कुछ तकनीकी उपर्युक्त विवरण, दोहराया जाना चाहिए. विशेष रूप से, कोशिकाओं को स्वस्थ और किसी भी संक्रमण के बिना किया जाना चाहिए. यह सर्वविदित है कि प्रयोगशाला उपभेदों अनुकूलित है जो लंबी अवधि के लिए नहीं किया गया पार कर दी है अच्छी तरह से दोस्त नहीं हो सकता है, और पानी की गुणवत्ता भी gametogenesis प्रभावित कर सकता है.
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Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल Institut डी भौतिक Chimique Biologie, पेरिस, फ्रांस में Wollman फ्रांसिस - आन्द्रे की प्रयोगशाला में सीखा तकनीकों पर आधारित है. लेखक जैकलिन गिरार्ड Bascou, जो मूल Chlamydomonas आनुवंशिक तकनीक के लिए डीबीएस शुरू करने के लिए आभार का एक ऋण देने Chlamydomonas अनुसंधान लेखकों प्रयोगशाला में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार MCB 0646350 द्वारा समर्थित है ..
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
