Summary
Спаривание и тетрады разделение необходимо для генетического анализа в
Abstract
Одноклеточная зеленая водоросль
Protocol
Часть 1: Подготовка штаммов для гаметогенеза
Примечание: Все манипуляции должны проводиться при комнатной температуре. Высшее или более низких температурах будут влиять на скорость прорастания и зигота может негативно повлиять жизнеспособность.
Важное внимание: важно, чтобы штаммов для повязана которые быстро растет и свободных от загрязнения грибов или бактерий. Если штаммы не были переданы регулярно, проезд на богатых среда должна предшествовать поколения гамет.
- Штаммы быть повязана переносятся на TAP пластины (100 × 15 мм), 1-2 штаммов на чашку. Клетки должны быть выращены в концентрированном полосу около 1 см в ширину.
- Инкубационный на вынос плиты должны продолжаться, пока толстый слой энергично растущих клетках присутствует, с промежуточными переводы, если это необходимо. Штаммы, которые не были пассировать в последнее время может потребоваться один проход и в общей сложности 1 неделю, в то время штаммов дикого типа в регулярное использование может осуществляться только через несколько дней и не пассажи. Мутанты, которые являются светочувствительными может потребоваться дополнительное время.
- Перенесите все клетки из-под крана пластины N10 плиты, которые испытывают дефицит азота и начнут вызывать гаметогенеза. Передача клеток толстой плите, сколько они присутствовали на TAP пластины. Это будет способствовать последующего сбора клеток. Через 3 дня на N10, клетки готовы пройти гаметогенеза. Деление клеток будет медленным на N10, однако клетки должно оставаться темно-зеленые. Все загрязненные штаммы должны быть отброшены как жизнеспособные зиготы не будут получены.
Часть 2: Спаривание
- Каждый штамм передается в 50 мл колбу Эрленмейера и ресуспендировали приблизительно в 2,5 мл стерильной дистиллированной воды. Это можно сделать либо с помощью проволочного или стерильной палочкой; важно то, что клетки хорошо подвешен, а не в сгустки. Точный объем воды должен быть отрегулирован таким образом, чтобы концентрации клеток, а судить на глаз, примерно такая же, для каждого штамма.
- Клетки взволнованным при сильном освещении (1,260 Е μ / м 2 / сек) в течение 2 часов, в течение которых клетки станут подвижных гамет. Подвижность должны быть проверены под световым микроскопом. Если гаметы плавают плохо, спаривания, вероятно, будет неэффективным. Однако, даже слабо подвижные штаммы будут спариваться снижение частоты.
- Далее, равные объемы мт + и МТ-гамет объединяются в одном 50 мл колбу. Гаметы остаются под сильным светом (1,260 Е μ / м 2 / сек) без перемешивания.
- Спаривание может быть проверено непосредственно под световым микроскопом. Пары гамет форму быстро, и будет выглядеть как быстро движущихся клетки вступил в жгутики. Если спаривание, как представляется, чрезвычайно быстрое, образцы должны быть приняты в течение 30 мин -1 час для генерации зиготы. Если нет, то спаривание может быть проверен каждый час, хотя это не является обязательным. Со времен дает оптимальную плотность зигот будут существенно различаться между крестами, то лучше взять аликвоты спаривания смеси в разное время после объединения гамет, например, через 1 час, 2 часа, 3 часа и 4 часа. Это делается путем передачи 300 мкл образцов для TAP-3% Difco агар 60 × 15 мм пластинами, 3-4 места на чашку. Будьте осторожны, чтобы не волновать спаривания смеси, поскольку это может нарушить брачный пар. Difco агар используется потому, что она имеет меньше загрязняющих веществ, чем дешевого агары, и это будет легче увидеть зиготы под микроскопом.
Неиспользованную смесь спаривания может быть оставлен в колбу на ночь, и качество спаривания реакция будет очевидным на следующий день. При спаривании эффективна, зиготы будет придерживаться стены или нижней части колбы и среду появятся ясно. Даже агитации колбу не удастся выбить зиготы. Если ничего не прилипает к стеклу, когда смесь перемешивают с достаточной силой, то спаривание было неэффективно или не состоится. - TAP-Difco чашки, содержащие спаривания смесь сушат в стерильных капота, крышки с приоткрытой, пока любой поверхности жидкость не впитается. Пластины, как правило, остается в свет (700 ПЕ / м 2 / сек) в течение 18 часов, затем, завернутые в фольгу, так как зигоспора созревания будет иметь место только в темноте. Штаммов на ногу, брачный период и дата записываются на обеих пластин и фольги. Плиты хранятся 5 до 7 дней и может храниться дольше, хотя зиготы эффективности прорастания снижается постепенно.
Часть 3: Тетрада Dissection
- Вегетативные клетки должны быть соскрести сухой капли спаривания смесь, используя лезвие скучно, такие, как скальпель. Лезвие может быть использовано для подвергать области зиготы, которая будет придерживаться плотно 3% агара. Этот шаг обычно выполняется во второй половине дня, так что зиготы проросли на следующее утро, но не прошедшие во-вторых, вегетативная подразделение, которое будетВыход 8 потомства. Chlamydomonas биологи быстро научиться распознавать зиготы под микроскопом, так как они больше, чем вегетативные клетки, а также функция толстой зигоспора стены, которая дает черным контуром. Зигоспор часто появляются желтые, но также может быть несколько зеленых. Наиболее важный персонаж в том, что они придерживаются агар, в то время как вегетативные клетки легко отошла в сторону. Однако, если пластины чрезмерно сухой этого не будет дела. Кроме того, если спаривание смесь слишком плотный, зиготы могут образовывать коврик, который сделает передачу отдельных зиготы трудно или невозможно. Соответствующие плотности устанавливаются в шаге 2.1, и будет быстро понял, с опытом.
- Стекло иглы готовы для сбора и разделения зиготы тетрады потомства. Они подготовлены, потянув 3 стержней мм стекла в маленькое пламя генерировать длинные, тонкие нити, которые могут быть прерваны. Кончики этих конические концы сглажены или согнут в крючки, краткие отопления в маленьком огне (например, алкоголь или горящая спичка). Подготовка 3 и более иглами стекла, так как они ломаются довольно легко, особенно для неопытных пользователей.
- Зиготы собраны на 3% TAP-Difco пластине с помощью стеклянной иглы в небольшие кучи. Квадрат агар (до 0,5 см 2) содержащие зиготы формируется и вырезали использованием тупой скальпель. Затем, агар блок размещен лицом вниз на 15 мм, 1,5% TAP-Difco пластины, и скользнул вдоль горизонтальной линии, около 1,5 см от верхней плиты, распространять зиготы. Верхней горизонтальной линии, а сетка с примерно 1,5 см по горизонтали и 0,5 см межстрочный интервал лежит печать в заднюю часть пластины. Сетка будет использован следующий день в качестве ориентира для разделения тетрад потомство (сетки также может быть травление день вскрытия). Наконец, отдельные зиготы перейти на пересечении верхней горизонтальной линии с каждой вертикальной линии, при этом около 20-30 зиготы на чашку. Хотя только 12 или около того будет рассеченные, не каждая зигота прорастает, и некоторые из них делятся дважды, прежде чем взрыв, так что дополнительные зиготы необходимы.
- После распространения зиготы, и вегетативных клеток, которые были случайно передается от 3% агар пластины убивают, подвергая перевернутую пластину в течение 30 секунд через стеклянное блюдо содержащих тонкие (1-2 мм) слой хлороформа. Расстояние между пластиной и хлороформ должно быть около 5 см. Если слишком много хлороформ используется, или если расстояние слишком маленькое или большое, один риски либо убийство зиготы, или не убивать вегетативные клетки. Лечение хлороформ должно быть сделано сразу же после зигоспор были распространены на прорастание пластины, чтобы обеспечить селективность.
- Прорастание занимает 16-20 часов для большинства штаммов, но и будет меняться в зависимости от генотипа и с возрастом зиготы. Для прорастания, пластины размещаются при слабом освещении (239 ПЕ / м 2 / сек), или в среде свет серым цветом, покрывая пластина с тканью.
- Проросшие зиготы могут быть идентифицированы под микроскопом, как опухшие, а иногда и взрыв клетки дочерние клетки внутри них. Если зигоспора не разорван, слегка касаясь со стеклянной иглы сломает стену, если прорастание произошло. Дочь клетки осторожно потащил к сети пунктов ниже зиготы. Это проще всего сделать это путем захвата ячейки в небольшое количество жидкой среде освобожден из агар давлением стекла иглой, и перетащить эту "лужу" за иглу. Одной из форм "страхование", что надо расчлененный зиготы, а не вегетативной ячейку, дважды разделен, является то, что помимо четырех дочерних клеток, "кожа" из зигоспора стене останется.
- Расчлененный потомство выращивается в соответствующих условиях, пока видимых clonies могут быть получены для последующего анализа. Плиты необходимо ежедневное наблюдение за загрязнением.
Примечание: Генерация вегетативной диплоиды здесь не рассматривается, но по сути включает в себя покрытие спаривания смесь на среду, которая не будет поддерживать развитие как родительский штамм, но и будет поддерживать рост диплоидных (например, два различных маркеров auxotropic). Плиты хранятся в свет, чтобы избежать образования зиготы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генетический анализ прост в Chlamydomonas, но она требует конкретных методов для создания половых клеток и отдельных потомства тетрады. При здоровых штаммов, методы легко приобретены. С некоторыми мутантных штаммов, становится больше искусство, а читателям следует обращаться Том 1 недавно опубликованной Chlamydomonas Справочник по историческим заметки и практических советов. Кроме того, следует отметить, что Есть много вариаций на основную тему, описанных выше, начиная от метода для стимуляции гаметогенеза, чтобы структура зиготы распределения и рассечение. В конечном счете, каждый исследователь находит их зоны комфорта, или адаптируется к лабораторным конкретных протоколов.
Некоторые технические детали уже упоминалось выше, должна быть подчеркнута. В частности, клетки должны быть здоровыми и без каких-либо инфекции. Хорошо известно, что лабораторные адаптированные штаммы, которые не перешли в течение длительного времени не могут спариваться хорошо, и качество воды может также повлиять гаметогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот протокол основан на навыки, полученные в лаборатории Фрэнсиса-Андре Вольман в Институте де Biologie физико-Chimique, Париж, Франция. Авторы в долгу благодарности к Жаклин Girard-Bascou, который первоначально введена DBS к Chlamydomonas генетических методов. Chlamydomonas исследования в лаборатории авторов при поддержке Национального научного фонда награду MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
