Summary
Apareamiento y la separación tétrada se requieren para el análisis genético en
Abstract
El alga verde unicelular
Protocol
Parte 1: Preparación de las cepas de la gametogénesis
Nota: Todas las manipulaciones deben llevarse a cabo a temperatura ambiente. Temperaturas altas o más bajas que afectan a la velocidad de germinación cigoto y puede afectar negativamente a la viabilidad.
Consideración importante: Es esencial que las cepas que se aparearon están creciendo vigorosamente y están libres de contaminación de hongos o bacterias. Si las tensiones no han sido transferidos con regularidad, el paso en medio rico debe preceder a la generación de gametos.
- Las cepas que se aparearon se transfieren a placas TAP (100 x 15 mm), 1-2 cepas por placa. Las células deben ser cultivadas en una franja concentrada alrededor de 1 cm de ancho.
- Incubación en placas TAP debe continuar hasta que una capa gruesa de células de crecimiento robusto está presente, con transmisiones intermedias, si es necesario. Las cepas que no han sido recientemente pasajes pueden requerir un pasaje y un total de 1 semana, mientras que las cepas salvajes en el uso regular sólo puede tomar unos pocos días y los pasajes no. Mutantes que son sensibles a la luz puede requerir más tiempo.
- La transferencia de todas las células de las placas TAP a las placas N10, que son deficientes de nitrógeno y comenzará a inducir la gametogénesis. Transferencia de las células como una losa de espesor, todo lo que estuvieron presentes en la placa de TAP. Esto facilitará la posterior recogida de las células. Después de 3 días en N10, las células están dispuestas a someterse a la gametogénesis. La división celular es lento en la N10, sin embargo, las células deben permanecer de color verde oscuro. Cualquier cepa contaminada debe ser descartado como cigotos viables no se obtendrá.
Parte 2: El apareamiento
- Cada cepa se transfiere a un matraz Erlenmeyer de 50 ml y se resuspendió en aproximadamente 2,5 ml de agua destilada estéril. Esto se puede hacer ya sea usando un asa de alambre o un palo estéril, lo importante es que las células están bien baja y no en grupos. El volumen exacto de agua debe ser ajustada de manera que la concentración celular, medido por los ojos, es casi el mismo para cada cepa.
- Las células se agitan bajo una luz intensa (1.260 E μ / m 2 / s) por 2 horas, tiempo durante el cual las células se convertirán en los gametos móviles. Motilidad debe evaluarse bajo un microscopio de luz. Si los gametos son la natación mal, el apareamiento es probable que sea ineficaz. Sin embargo, incluso mal cepas móviles se aparea con una frecuencia reducida.
- Volúmenes que viene, igual de mt + y mt-gametos se combinan en un matraz aforado de solo 50. Los gametos se dejan bajo una luz intensa (1.260 E μ / m 2 / s) sin agitación.
- El apareamiento se puede comprobar de inmediato bajo el microscopio de luz. Pares de gametos se forman rápidamente, y aparecen como células de rápido movimiento se unió a los flagelos. Si el apareamiento parece ser muy rápido, las muestras deben ser tomadas dentro de los 30 minutos por hora -1 para la generación de cigotos. Si no, el apareamiento se puede comprobar cada hora, aunque esto es opcional. Desde los tiempos de dar la densidad óptima de los cigotos se varían ampliamente entre los cruces, lo mejor es tomar alícuotas de la mezcla de apareamiento en momentos diferentes después de la combinación de los gametos, por ejemplo, después de 1 hora, 2 horas, 3 horas y 4 hrs. Esto se hace mediante la transferencia de 300 muestras de l a TAP-3% de agar Difco 60 x 15 mm placas, manchas 04.03 por placa. Tenga cuidado de no agitar la mezcla de apareamiento, ya que puede alterar parejas de apareamiento. Agar Difco se utiliza porque tiene menos contaminantes que los de menor precio agar, y será más fácil ver los cigotos en el microscopio.
La mezcla de apareamiento no utilizados pueden ser dejados en el matraz durante la noche, y la calidad de la reacción de acoplamiento será evidente al día siguiente. Cuando el apareamiento es eficiente, los cigotos se adhiere a la pared o el fondo del recipiente y el medio se parece clara. Incluso la agitación del matraz no podrá desalojar a los cigotos. Si nada se pega al vidrio cuando se agita con fuerza razonable, entonces el apareamiento era ineficiente o no tener lugar. - Las placas TAP Difco mezcla que contiene el apareamiento se secan en una campana estéril, con las tapas entreabiertas, hasta que el líquido se haya absorbido la superficie. Las placas normalmente se dejan en la luz (700 NE / m 2 / s) durante 18 horas, luego se envuelve en papel de aluminio, ya que la maduración zigospora sólo se llevará a cabo en la oscuridad. Las cepas cruzados, el apareamiento de fecha y hora están escritas en ambos las placas y láminas de la. Las placas se almacenan 5 a 7 días y se puede mantener más tiempo, aunque la eficiencia de la germinación cigoto disminuye progresivamente.
Parte 3: Disección Tétrada
- Las células vegetativas debe ser quitado manchas secas de la mezcla de apareamiento con una cuchilla sin filo, como un bisturí. La hoja puede ser utilizada para exponer un área de cigotos, que se adhieren firmemente al agar al 3%. Este paso se realiza generalmente en la tarde, de modo que los cigotos han germinado a la mañana siguiente, pero no han sido objeto de una segunda división, vegetativa,Rinde 8 progenie. biólogos Chlamydomonas rápidamente aprenden a reconocer los cigotos en el microscopio, ya que son más grandes que las células vegetativas, y cuentan con una pared gruesa zigospora que da un contorno negro. Zygospores a menudo presentan un color amarillo, pero también puede ser un poco verde. El personaje más importante es que se adhieren a agar, mientras que las células vegetativas son fácilmente a un lado. Sin embargo, si las placas son demasiado seca no será el caso. Además, si la mezcla de apareamiento era demasiado densa, los cigotos se puede formar una alfombra de lo que hará que la transferencia de cigotos persona difícil o imposible. Densidades apropiadas se establecen en el paso 2.1, y un rápido aprendizaje de la experiencia.
- Agujas de vidrio se preparan para la recolección y separación de los cigotos progenie tétrada. Estos son preparados por tirar 3 varillas de vidrio mm en una pequeña llama para generar un hilo largo y delgado, que puede ser roto. Las puntas de estos extremos afilados o se suavizan doblado en los ganchos, por el calentamiento breve a fuego lento (por ejemplo, alcohol o una cerilla encendida). Prepare 3 o más agujas de vidrio, ya que se rompen con bastante facilidad, sobre todo para usuarios inexpertos.
- Cigotos se reunieron en el 3% de TAP-Difco placa con una aguja de cristal en un pequeño montón. Un cuadrado de agar (hasta 0,5 cm 2) que contiene los cigotos se forma y se extirpa con un escalpelo aburrido. A continuación, el bloque de agar se coloca boca abajo en un 15 mm 1,5% TAP-Difco placa, y se deslizó a lo largo de una línea horizontal de 1,5 cm desde la parte superior de la placa, la distribución de los cigotos. La línea horizontal superior, y una red con aproximadamente 1,5 cm horizontal y 0,5 cm de separación verticales son grabadas en la parte posterior de las placas. La red será utilizada al día siguiente como una guía para la separación de la progenie tétrada (la red también puede ser grabado al agua fuerte el día de la disección). Finalmente, los cigotos individuales se mueven a las intersecciones de las líneas horizontal superior, con cada línea vertical, con unos 20-30 cigotos por placa. Aunque sólo el 12 o así será disecado, no todos los cigoto germina, y algunos se divide dos veces antes de estallar, por lo cigotos adicionales son necesarios.
- Después de la distribución de los cigotos, y las células vegetativas que se han transferido de forma accidental la placa de agar 3% son asesinados por la exposición de la placa invertida durante 30 segundos sobre un plato de cristal que contienen una capa delgada (1.2 mm) de la capa de cloroformo. La distancia entre la placa y el cloroformo deben quedar unos 5 cm. Si el cloroformo se usa demasiado, o si la distancia es demasiado grande o pequeño, se corre el riesgo ya sea matando a los cigotos o no matar a las células vegetativas. El tratamiento de cloroformo se debe hacer inmediatamente después de la zygospores se han distribuido en la placa de la germinación, para garantizar la selectividad.
- La germinación tarda entre 16-20 horas para la mayoría de las cepas, pero puede variar con el genotipo y la edad de los cigotos. Para la germinación, las placas se colocan bajo condiciones de poca luz (239 NE / m 2 / seg), o en la luz atenuada medio cubriendo la placa con un pañuelo.
- Cigotos germinar se pueden identificar con el microscopio las células inflamadas o estallar a veces con células hijas dentro de ellos. Si el zigospora no se ha roto, tocando suavemente con una aguja de vidrio se rompe la pared si se ha producido la germinación. Las células hijas son suavemente arrastrado a los puntos de la red por debajo del cigoto. Es más fácil hacer esto mediante la captura de la célula en una pequeña cantidad de medio líquido liberado del agar por la presión de la aguja de vidrio, y arrastrando el "charco" detrás de la aguja. Una forma de "seguro" de que uno ha diseccionado un cigoto y no una célula vegetativa que se divide en dos ocasiones, es que aparte de las células hija de cuatro, la "piel" de la pared zigospora seguirá siendo.
- La progenie disecados se cultivan en condiciones adecuadas hasta clonies visibles pueden ser recogidos para su posterior análisis. Las placas deben ser controlados diariamente por la contaminación.
Nota: La generación de diploides vegetativo no se describe aquí, pero básicamente consiste en la mezcla de revestimiento de apareamiento en un medio que no va a apoyar el crecimiento de cualquier cepa parental, pero apoyará el crecimiento de la diploide (por ejemplo, dos marcadores auxotropic diferentes). Las placas se mantienen a la luz para evitar la formación de cigotos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El análisis genético es simple en Chlamydomonas, pero requiere de técnicas específicas para generar gametos y progenie tétrada separado. Con cepas sanas, las técnicas son fáciles de adquirir. Con algunas cepas mutantes, se convierte más en un arte, y los lectores deben consultar el volumen 1 del Libro recientemente publicado Chlamydomonas de notas históricas y consejos prácticos. Además, debe tenerse en cuenta que hay muchas variaciones sobre el tema básico descrito anteriormente, que van desde el método para inducir la gametogénesis, con el patrón de distribución de cigoto y la disección. En última instancia, cada investigador encuentra su zona de confort, o se adapta a los protocolos específicos de laboratorio.
Algunos detalles técnicos antes mencionados, debe reiterarse. En particular, las células deben estar sanos y sin ningún tipo de infección. Es bien sabido que el laboratorio de cepas adaptadas a la que no se han cruzado durante largos períodos no encajen bien y la calidad del agua también puede afectar a la gametogénesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este protocolo se basa en las técnicas aprendidas en el laboratorio de Francis-André Wollman en el Instituto de Francia Biologie físico-Chimique, París,. Los autores tienen una deuda de gratitud a Jacqueline Girard-Bascou, que originalmente presentó a las técnicas de estimulación cerebral profunda Chlamydomonas genética. Chlamydomonas la investigación en laboratorio de los autores con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias premio MCB-0646350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
