Summary
Parning och tetrad separation krävs för genetisk analys
Abstract
Den encelliga grönalger
Protocol
Del 1: Förberedelse av stammar för gametogenes
Notera: Alla manipulationer bör utföras vid rumstemperatur. Högre eller lägre temperaturer påverkar hastigheten på zygoten grobarhet och kan påverka lönsamheten.
Viktig faktor: Det är viktigt att de stammar som ska paras växer kraftigt och är fria från kontaminerande svampar eller bakterier. Om stammar som inte har överförts regelbundet bör passage på rika medelstora föregå generation av könsceller.
- Stammar som ska paras överförs till TAP plattor (100 × 15 mm), 1-2 stammar per platta. Cellerna bör odlas i ett koncentrerat remsa ca 1 cm i bredd.
- Inkubering på TAP plattor bör fortsätta tills ett tjockt lager av kraftigt växande celler är närvarande, med mellanliggande överföringar om det behövs. Stammar som inte har passerats senare kan kräva en passage och sammanlagt en vecka, medan vildtyp stammar i regelbunden användning kan bara ta ett par dagar och inga passager. Mutanter som är ljuskänsliga kan kräva ytterligare tid.
- Överför alla celler från kranen plattorna N10 plattor, som är bristfälliga för kväve och kommer att börja framkalla gametogenes. Överför cellerna som en tjock platta, ungefär som de var närvarande på TAP plattan. Detta kommer att underlätta den efterföljande insamlingen av celler. Efter 3 dagar på N10, är de celler beredda att genomgå gametogenes. Celldelning kommer att vara långsam på N10, men celler bör förbli mörkgrön. Förorenade stammar kasseras som livskraftig zygotes inte kommer att erhållas.
Del 2: Parning
- Varje stam överförs till en 50 ml E-kolv och suspenderade i ca 2,5 ml sterilt destillerat vatten. Detta kan göras antingen med en tråd slinga eller en steril pinne, det viktiga är att cellerna väl svävande och inte i klumpar. Den exakta mängden vatten bör justeras så att cellkoncentrationen, som mätas med ögat, är ungefär samma för varje stam.
- Celler är upprörd under ett starkt ljus (1,260 μ E / m 2 / s) i 2 timmar, under vilken tid de celler blir rörliga könsceller. Motiliteten bör kontrolleras under ett ljusmikroskop. Om könscellerna simmar dåligt, är parning kommer att vara ineffektivt. Kommer dock även dåligt rörliga stammar parar en minskad frekvens.
- Nästa, lika volymer av mt + och MT-könsceller kombineras till en enda 50 ml kolv. Könsceller finns kvar under ett starkt ljus (1,260 μ E / m 2 / s) utan agitation.
- Parning kan kontrolleras omedelbart under ljusmikroskop. Par av könsceller formen snabbt, och kommer att visas så snabbt att flytta celler gick i flageller. Om parning verkar vara extremt snabb, bör prover tas inom 30 min -1 tim för generering av zygotes. Om inte, kan parning kontrolleras varje timme, men det är valfritt. Eftersom gånger ger optimal täthet zygotes kommer att variera kraftigt mellan kors, är det bäst att ta alikvoter av parningen blandningen vid olika tidpunkter efter kombinera könsceller, t.ex. efter 1 timme, 2 timmar, 3 timmar och 4 timmar. Detta görs genom att överföra 300 mikroliter prover till TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm plattor, 3-4 prickar per platta. Var noga med att inte uppröra parningen blandningen eftersom detta kan störa parningen par. Difco agar används för att det har färre föroreningar än billigare agars, och det blir lättare att se zygotes under mikroskop.
De oanvända parning blandningen kan kvar i flaskan över natten, och kvaliteten på parning reaktionen kommer att bli uppenbara nästa dag. När parningen är effektiv, kommer zygotes ansluta sig till väggen eller botten av kolven och mediet kommer att visas tydligt. Även agitation i kolven inte kommer att rubba de zygotes. Om inget fastnar på glaset när blandningen rörs med rimlig kraft, sedan parning var ineffektivt eller inte ske. - TAP-Difco plattor som innehåller parning blandning torkas i en steril huva, med lock på glänt, tills någon yta vätska har absorberats. Plattorna är vanligtvis kvar i ljuset (700 N / m 2 / sek) i 18 timmar, sedan insvept i folie, eftersom zygospore mognad kommer endast att ske i mörker. Den stammar korsade, parning tid och datum är skrivna på både tallrikar och folien. Plattor lagras 5 till 7 dagar och kan hållas längre, även om zygot groning effektivitet minskar successivt.
Del 3: tetrad Dissection
- Vegetativa celler bör skrapas bort torkade fläckar av parning blandning med hjälp av ett slött rakblad, till exempel en skalpell. Bladet kan användas för att exponera en yta på zygotes, som kommer att hålla hårt på 3% agar. Detta steg görs oftast på eftermiddagen, så att zygotes har grott av nästa morgon, men har inte genomgått en andra, vegetativt division som skulleger 8 avkommor. Chlamydomonas biologer snabbt lär sig att känna igen zygotes i mikroskop, eftersom de är större än vegetativa celler, och har en tjock zygospore mur som ger en svart kontur. Zygospores visas ofta gult men kan också vara något grön. Det viktigaste tecknet är att de håller sig till agar, medan vegetativa celler lätt flyttas åt sidan. Men om plattorna alltför torr så inte blir fallet. Dessutom, om parningen blandningen var för tät, kan zygotes bilda en matta som gör överföringen av enskilda zygotes svårt eller omöjligt. Lämpliga densiteter är etablerade i steg 2,1, och kommer att snabbt lära med erfarenhet.
- Glas nålar är förberedda för att samla in zygotes och separera tetrad avkomma. Dessa förbereds genom att dra tre stavar mm glas i en liten låga för att generera en lång, tunn tråd, som kan brytas av. De tips av dessa koniska ändarna utjämnas eller böjda i krokarna av korta uppvärmning i en svag låga (t.ex. alkohol eller en brinnande tändsticka). Förbered tre eller fler glas nålar, eftersom de bryts ganska lätt, speciellt för oerfarna användare.
- Zygotes samlas på 3% TAP-Difco tallrik med ett glas nål i en liten hög. En ruta av agar (upp till 0,5 cm 2) innehåller zygotes bildas och skärs med hjälp av en tråkig skalpell. Då är den agar placerat nedåt på en 15 mm 1,5% TAP-Difco platta, och gled längs en horisontell linje ca 1,5 cm från plattans överkant, att fördela zygotes. Den översta horisontella linjen och ett rutnät med ca 1,5 cm horisontella och 0,5 cm vertikala avståndet är etsade i baksidan av plattorna. Rutnätet ska användas följande dag som vägledning för att skilja tetrad avkomman (rutnätet kan också etsas dagen för dissekering). Slutligen flytta enskilda zygotes till korsningar av de horisontella linjerna med varje vertikal linje, med ca 20-30 zygotes per platta. Även om endast 12 eller så kommer att dissekeras, inte varje zygot gror, och vissa kommer att dela upp två gånger tidigare spricker, så extra zygotes behövs.
- Efter att distribuera zygotes och vegetativa celler som har oavsiktligt överförts från 3% agarplatta dödas genom att exponera den inverterade plattan i 30 sekunder under en glasskål med en tunn (1-2 mm) lager av kloroform. Avståndet mellan plattan och kloroform bör vara ca 5 cm. Om för mycket kloroform används, eller om avståndet är för liten eller stor, en risk att döda antingen zygotes eller inte döda den vegetativa celler. Den kloroform behandlingen måste göras omedelbart efter zygospores har fördelats på groning plattan, för att säkerställa selektivitet.
- Groning tar 16-20 timmar för de flesta stammar, men varierar med genotyp och med ålder zygotes. För groning är plattorna placeras i svagt ljus (239 N / m 2 / sek), eller i medium ljuset dämpas genom att täcka plattan med en vävnad.
- Grodde zygotes kan identifieras i mikroskop som svullnad eller ibland brister celler med dottern celler inuti dem. Om zygospore inte har spruckit, kommer att försiktigt röra med ett glas nål bryta väggen om grobarheten har inträffat. Dotter celler är försiktigt dras till nätet punkter under zygot. Det är lättast att göra detta genom att fånga cellen i en liten mängd vätska frigörs från agar av trycket av glaset nålen och dra denna "vattenpöl" bakom nålen. En form av "försäkring" att man har dissekerat en zygot och inte en vegetativ cell som två gånger har delat, är att förutom de fyra dotter celler, kommer "hud" av zygospore muren kvar.
- Den dissekerade Avkomman odlas under lämpliga förhållanden tills synliga clonies kan plockas för senare analys. Plattor bör övervakas dagligen för föroreningar.
Obs: Generering av vegetativ diploider inte här, men i grunden handlar om bordläggning parningen blandningen på medium som inte kommer att stödja tillväxten av antingen moderstammen, men kommer att stödja tillväxten av diploida (t.ex. två olika auxotropic markörer). Plattorna hålls i ljuset för att undvika bildandet av zygotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk analys är enkel i Chlamydomonas, men det kräver särskild teknik för att generera könsceller och separat tetrad avkomma. Med friska stammar, är de tekniker som lätt förvärvats. Med vissa muterade stammar, blir det mer av en konst, och läsare bör hänvisa volym 1 av den nyligen publicerade Chlamydomonas Sourcebook för historiska anteckningar och praktiska tips. Dessutom bör det noteras att det finns många variationer på det grundläggande temat beskrivs ovan, från den metod för att framkalla gametogenes, att mönstret av zygoten distribution och dissektion. I slutändan finner varje forskare sin komfortzon, eller anpassar sig till laboratoriespecifika protokoll.
Vissa tekniska detaljer som nämns ovan, bör upprepas. I synnerhet måste cellerna vara friska och utan infektion. Det är väl känt att laboratoriet anpassade stammar som inte har passerat under långa perioder inte kan para sig väl och vattenkvalitet kan också påverka gametogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta protokoll är baserat på tekniker lärt sig i laboratoriet av Francis-André Wollman vid Institut de Biologie fysikalisk-Chimique, Paris, Frankrike. Författarna är skyldig en skuld av tacksamhet till Jacqueline Girard-Bascou, som ursprungligen infördes DBS till Chlamydomonas genteknik. Chlamydomonas forskning i författarnas laboratoriet stöds av National Science Foundation Award MCB-0.646.350.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
