Summary
Deze video laat zien hoe u abdominale aorta-aneurysma (AAA) te induceren in muizen via voorbijgaande intraluminale infusie van varkens pancreas elastase in de infrarenale segment van de abdominale aorta. Het model heeft de mogelijkheid om breed inzicht toe te voegen in de pathobiologie van AAA te wijten aan de opkomst van tal van transgene en knockout muizen.
Abstract
Voorbijgaande intraluminale infusie van varkens pancreas elastase in de infrarenale segment van de abdominale aorta is de meest gebruikte diermodel van de abdominale aorta aneurysma (AAA) sinds het voor het eerst werd beschreven in ratten door Anidjar en collega's. 1 De reden voor de ontwikkeling is gebaseerd op de verstoorde aard van de elastine waargenomen in AAA. Deze rat model is aangepast aan AAA produceren in de infrarenale aorta gebied van muizen. 2 Het model heeft de mogelijkheid om breed inzicht toe te voegen in de pathobiologie van AAA te wijten aan de opkomst van tal van transgene en knockout muizen. Bovendien is het een levensvatbaar platform om potentiële therapeutische middelen test voor AAA. In deze video, tonen we de elastase infuus AAA procedure die wordt gebruikt in ons laboratorium.
Muizen zijn verdoofd met behulp van 2,5% isofluraan, en een laparotomie wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden. De abdominale aortais geïsoleerd met behulp van een werkend stereomicroscoop (Leica). Na het plaatsen van een tijdelijke ligaturen rond de proximale en distale aorta, is een aortotomy gemaakt op de splitsing met de punt van een 30-gauge naald. Een warmte-taps segment van de PE-10 polyethyleen buis is ingevoerd door de aortotomy en beveiligd. De aorta-lumen wordt vervolgens doorbloed voor 5-15 minuten op 100 mm Hg met een zoutoplossing die type I varkens pancreas elastase (4,5 U / ml; Sigma Chemical Co.) Na het verwijderen van de perfusie katheter, is de aortotomy gerepareerd zonder vernauwing van het lumen.
Protocol
- Muizen worden verdoofd met inhalatie isofluraan 2.0-3.0ml / L.
- De buik wordt geschoren en gewassen met alcohol en betadine.
- De muis op de rug ligt op het operatiegebied.
- Steriele handschoenen worden gedragen door de chirurg, en de gebruikte instrumenten zijn gesteriliseerd met hete kraal sterilisator.
- Een lange middellijn incisie in de buik wordt gemaakt. Buikinhoud worden teruggetrokken buiten de buik met een steriel gaasje op de abdominale aorta bloot te leggen.
- De abdominale aorta is geïsoleerd van het niveau van de linker nier-ader aan de bifurcatie.
- De takken van de abdominale aorta worden blootgesteld en geligeerd met 10-0 hechtingen. Alle aorta takken binnen 1.0cm van de splitsing worden geligeerd.
- Tijdelijke 6,0 zijde ligaturen zijn geplaatst rond de proximale en distale delen van de aorta
- Een aortotomy wordt gemaakt op de splitsing met een 30-gauge naald.
- Warmte-taps polyethyleen buis (PE-10) is geïntroduceerd door de aortotomy en vastgezet met een gelijkspel.
- Met behulp van een zoutoplossing tas hing op een hoogte van 136 cm tot 100 mmHg kalibreren, wordt de aorta gevuld met de zoutoplossing die 4,5 U / ml Type I varkens pancreas elastase. De aorta verwijdt meestal tot 150-170% van zijn oorspronkelijke diameter in 5-15 minuten elastase perfusie.
- De perfusie katheter wordt vervolgens verwijderd en de aortotomy afgesloten met een 10-0 hechtdraad tot vernauwing te voorkomen.
- Nadat de aortotomy is gesloten, wordt de distale ligatuur verwijderd.
- Als er weinig of geen bloeden van de gerepareerde aortotomy, is de proximale ligatuur verwijderd. De uitgebreide aorta vult met bloed onmiddellijk.
- De darmen worden teruggegeven aan de buik, en de wond wordt gesloten in twee lagen met 6-0 nylon / polypropyleen hechtdraad.
- 0,25% Bupivicaime druppels (appx een druppel voor elke centimeter van de incisie grootte) worden geplaatst op de wond en een dosis van Caprofen (5mg/kg) wordt subcutaan.
- De muis wordt geplaatst op een warme omgeving en meestal herstelt binnen de 15 minuten.
Figuur 1. Vertegenwoordiger Resultaat van Elastase geïnduceerde AAA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies hebben opgemerkt significante lot-tot-lot variatie in AAA ontwikkeling van verschillende commerciële elastase voorbereidingen 3. Zo is het essentieel om de productie te veel controleren, alsook de nodige controle groepen hebben om het vermogen van de voorbereiding op AAA veroorzaken document.
Interessant is dat gevoeligheid voor AAA ontwikkeling in dit model is afhankelijk van de muizenstam gebruikt 3. De muis gebruikt in de huidige video is van de C57Bl / 6 stam die consequente ontwikkeling van AAA met behulp van de geschetste protocol. Elastase concentratie en / of incubatietijd kan worden aangepast om andere stammen te passen.
Hoewel de techniek van de schepping van AAA met elastase in muizen is technisch een uitdaging, het is een belangrijke techniek voor het bestuderen van de onderliggende moleculaire mechanismen van AAA vorming en ontwikkeling. De praktijk en technische wijzigingen hebben geresulteerd in een slagingspercentage van meer dan 90% in ons laboratorium. Wij geloven dat de video en de begeleidende tekst zal bijdragen tot het verminderen van de leercurve voor de laboratoria die wensen om deze techniek te gebruiken.
Het oplossen van problemen
- De takken van de abdominale aorta moet worden afgebonden met 10-0 hechtingen, het voorkomen van bloeden tijdens de operatie en onvoldoende expansie tijdens elastase infusie als gevolg van lekken.
- Het is belangrijk om een duidelijke en uitgebreide operationele veld. Gebruik daarom 6-0 hechtdraad in plaats van klemmen om tijdelijk af te sluiten van de aorta
- Het lumen van de abdominale aorta moeten worden afgewikkeld met een zoutoplossing om trombose te voorkomen na de operatie.
- Het is belangrijk dat het topje van de warmte taps toelopende PE-10 buis moet glad zijn om te voorkomen krassen op de endotheliale laag bij geplaatst.
- Luchtbellen in de schepen moeten worden vermeden bij het inbrengen van elastase en wanneer de aortotomy gesloten is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund de SCCOR subsidie "AAA Disease: Mechanismen, gelaagdheid, en behandeling" (P50 HL083800-03) van de National Institutes of Health
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I porcine pancreatic elastase | Reagent | Sigma-Aldrich | E1250 | |
| polyethylene tubing (PE-10) | BD Biosciences | 427400 | ||
| CHANGE-A-TIP | Bovie Medical Corporation | 18010-00 (FST) | cautery knife | |
| LEICA MZ6 | Leica Microsystems | stereomicroscope | ||
| LEICA DFC290HD | Leica Microsystems | USB camera | ||
| Image Pro Express ver. 6.0 | Media Cybernetics Inc. | software |
References
- Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).
- Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).
- Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).
