Summary
Este vídeo mostra como induzir aneurismas da aorta abdominal (AAA) em camundongos através de infusão intraluminal transitória da elastase pancreática suína no segmento de infra-renal da aorta abdominal. O modelo tem a capacidade de adicionar uma visão ampla para o pathobiology da AAA, devido ao surgimento de inúmeros transgênicos e camundongos knockout do gene.
Abstract
Infusão intraluminal transitória da elastase pancreática suína no segmento de infra-renal da aorta abdominal é o modelo animal mais usado do aneurisma de aorta abdominal (AAA) desde que foi descrita pela primeira vez em ratos por Anidjar e colegas. Lógica 1 A para o seu desenvolvimento foi baseado sobre a natureza perturbada de elastina observado em AAA. Este modelo de rato tenha sido modificado para produzir AAA na região da aorta infra-renal de ratos. 2 O modelo tem a capacidade de adicionar uma visão ampla para o pathobiology da AAA, devido ao surgimento de inúmeros transgênicos e camundongos knockout do gene. Além disso, é uma plataforma viável para testar potenciais agentes terapêuticos para AAA. Neste vídeo, demonstramos o processo de infusão elastase AAA utilizado em nosso laboratório.
Os ratos são anestesiados com isoflurano 2,5%, e uma laparotomia é realizada sob condições estéreis. O aortais abdominal isolada com o auxílio de um estereomicroscópio operacional (Leica). Depois de colocar ligaduras temporário em torno da aorta proximal e distal, um aortotomia é criado na bifurcação com a ponta de uma agulha de calibre 30. Um segmento de calor cônico da PE-10 tubos de polietileno é introduzido através da aortotomia e seguro. A luz aórtica é posteriormente perfundidos por 5-15 minutos a 100 mm Hg com o tipo contendo salina eu suína elastase pancreática (4,5 U / mL; Sigma Chemical Co.). Após a remoção do cateter de perfusão, o aortotomia é reparado sem constrição da luz.
Protocol
- Os ratos são anestesiados com isoflurano inalado 2.0-3.0ml / L.
- O abdômen é raspado e limpo com álcool e betadine.
- O rato é colocado em posição supina sobre o campo operatório.
- Luvas estéreis são usadas pelo cirurgião, e os instrumentos utilizados foram esterilizados com esterilizador talão quente.
- A incisão mediana abdominal longa é feita. Conteúdo abdominal são retraídos fora do abdômen com gaze estéril para expor a aorta abdominal.
- A aorta abdominal é isolado a partir do nível da veia renal esquerda até a bifurcação.
- Os ramos da aorta abdominal são expostos e ligados com 10-0 suturas. Todos os ramos da aorta dentro de 1,0 centímetro da bifurcação são ligadas.
- Temporária 6,0 ligaduras de seda são colocados ao redor das partes proximal e distal da aorta
- Aortotomia é criado na bifurcação com uma agulha de calibre 30.
- Heat-cônico tubo de polietileno (PE-10) é introduzido através da aortotomia e garantiu com um empate.
- Usando um saco de soro pendurado na altura de 136 cm para calibrar 100 mmHg, a aorta é preenchido com solução salina contendo 4,5 U / mL Tipo I elastase pancreática suína. A aorta dilata normalmente a 150-170% do seu diâmetro original durante a perfusão elastase 15/05 minutos.
- O cateter de perfusão é então removido eo aortotomia fechada com uma sutura 10-0 para evitar a constrição.
- Após a aortotomia está fechado, a ligadura distal é removido.
- Se houver pouco ou nenhum sangramento da aortotomia reparado, a ligadura proximal for removido. A aorta expandiu enche de sangue imediatamente.
- Os intestinos são retornados para o abdômen, ea ferida é fechada em duas camadas com 6-0 nylon / polipropileno.
- 0,25% Bupivicaime gotas (appx uma gota para cada centímetro do tamanho da incisão) são colocados sobre a ferida e uma dose de Caprofen (5mg/kg) é administrada por via subcutânea.
- O mouse é colocado em uma área quente e geralmente se recupera dentro de 15 minutos.
Figura 1. Result Representante da Elastase induzida AAA.
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Discussion
Estudos anteriores observaram variação de lote para lote significativo no desenvolvimento de diferentes preparações AAA elastase comercial 3. Assim, é fundamental para monitorar lotes de produção, bem como ter grupos de controle apropriados a fim de documentar a capacidade da preparação para induzir AAA.
Curiosamente, a susceptibilidade para o desenvolvimento deste modelo AAA é dependente da cepa do mouse usado 3. O rato usado no vídeo atual é da cepa C57BL / 6, que tem um desenvolvimento consistente do AAA utilizando o protocolo apresentado. Concentração de elastase e / ou tempo de incubação pode ser ajustado para acomodar outras cepas.
Embora a técnica de criação de AAA com elastase em ratos é um desafio técnico, é uma técnica importante para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes de formação de AAA e desenvolvimento. Modificações práticas e técnicas resultaram em uma taxa de sucesso de mais de 90% em nosso laboratório. Acreditamos que o vídeo eo texto vai ajudar a reduzir a curva de aprendizado para os laboratórios que desejem utilizar esta técnica.
Solução de problemas
- Os ramos da aorta abdominal deve ser ligada com 10-0 suturas, evitando o sangramento durante a operação e expansão insuficiente durante a infusão de elastase por causa do vazamento.
- É importante ter um campo operacional clara e expansiva. Portanto, use 6-0 em vez de grampos para oclusão temporária da aorta
- O lúmen da aorta abdominal deve ser limpa com solução salina para prevenir a trombose após a operação.
- É importante que a ponta do tubo de calor PE-10 cônico deve ser suave para evitar arranhar a camada endotelial quando inserido.
- Bolhas de ar no interior dos vasos devem ser evitados quando infundindo elastase, bem como quando o aortotomia está fechado.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado a concessão SCCOR "Doença AAA: Mecanismos, estratificação e tratamento" (P50 HL083800-03) do National Institutes of Health
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I porcine pancreatic elastase | Reagent | Sigma-Aldrich | E1250 | |
| polyethylene tubing (PE-10) | BD Biosciences | 427400 | ||
| CHANGE-A-TIP | Bovie Medical Corporation | 18010-00 (FST) | cautery knife | |
| LEICA MZ6 | Leica Microsystems | stereomicroscope | ||
| LEICA DFC290HD | Leica Microsystems | USB camera | ||
| Image Pro Express ver. 6.0 | Media Cybernetics Inc. | software |
References
- Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).
- Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).
- Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).
