Summary
Dieses Video zeigt, wie man abdominalen Aortenaneurysmen (AAA) in Mäusen über vorübergehende intraluminale Infusion von Schweine-Pankreas-Elastase in der infrarenalen Segment der abdominalen Aorta induzieren. Das Modell verfügt über die Fähigkeit zur umfassenden Einblick in die Pathobiologie von AAA durch die Entstehung zahlreicher transgenen und Knockout-Mäuse hinzu.
Abstract
Transient intraluminale Infusion von Schweine-Pankreas-Elastase in der infrarenalen Segment der abdominalen Aorta ist die am weitesten verbreitete Tiermodell von Aortenaneurysmen (AAA), seit es zum ersten Mal in Ratten durch Anidjar und Kollegen beschrieben. 1 Die Begründung für seine Entwicklung beruhte auf die gestörte Natur von Elastin beobachtet in AAAS. Dieses Rattenmodell wurde geändert, um AAA in der infrarenalen Aorten-Region von Mäusen zu produzieren. 2 Das Modell verfügt über die Fähigkeit zur umfassenden Einblick in die Pathobiologie von AAA durch die Entstehung zahlreicher transgenen und Knockout-Mäuse hinzu. Darüber hinaus ist es eine tragfähige Plattform für potenzielle Therapeutika für AAA-Test. In diesem Video zeigen wir die Elastase Infusion AAA Verfahren in unserem Labor eingesetzt.
Mäuse sind narkotisiert mit 2,5% Isofluran und einer Laparotomie wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die abdominale aortais mit Hilfe eines Betriebssystems Stereomikroskop (Leica) isoliert. Nach der Platzierung temporäre Ligaturen um den proximalen und distalen Aorta, ist ein Aortotomie an der Bifurkation mit der Spitze einer 30-Gauge-Nadel erzeugt. Ein Wärme-konische Segment der PE-10 Polyethylen-Rohr wird durch die Aortotomie eingeführt und gesichert. Die Aorta wird anschließend für 5-15 Minuten bei 100 mm Hg mit Kochsalzlösung mit Typ-I-Schweine-Pankreas-Elastase (; Sigma Chemical Co. 4,5 U / ml) perfundiert. Nach dem Entfernen der Perfusionskatheter ist die Aortotomie ohne Einengung des Lumens repariert.
Protocol
- Mäuse sind mit inhalativen Isofluran 2,0-3.0ml / L. narkotisierten
- Der Bauch ist rasiert und gewaschen mit Alkohol und betadine.
- Die Maus wird in Rückenlage auf dem OP-Feld platziert.
- Sterile Handschuhe sind durch den Chirurgen getragen, und die verwendeten Instrumente sind mit heißem bead Sterilisator sterilisiert worden.
- Eine lange Mittellinie Bauchschnitt gemacht wird. Bauch-Inhalte liegen außerhalb der Bauchhöhle mit steriler Gaze der abdominalen Aorta freizulegen.
- Die Bauchaorta wird von der Ebene der linken Nierenvene zur Bifurkation isoliert.
- Die Äste der Bauchaorta freigelegt und ligiert mit 10-0 Nähten. Alle Aorten-Filialen innerhalb von 1,0 cm von der Bifurkation ligiert.
- Temporäre 6,0 Seidenligaturen sind rund um die proximalen und distalen Abschnitte der Aorta platziert
- Ein Aortotomie ist an der Bifurkation mit einer 30-Gauge-Nadel erzeugt.
- Heat-konische Polyethylen-Schlauch (PE-10) ist durch die Aortotomie eingeführt und mit einer Krawatte.
- Mit einer Kochsalzlösung Tasche hing in der Höhe von 136 cm bis 100 mmHg zu kalibrieren, wird die Aorta mit der Kochsalzlösung mit 4,5 U / ml Typ I Schweine-Pankreas-Elastase gefüllt. Die Aorta in der Regel erweitert, um 150-170% des ursprünglichen Durchmessers während der 5-15 Minuten Elastase Perfusion.
- Die Perfusion Katheter wird dann entfernt und die Aortotomie schloss mit einem 10-0 Naht zu Verengung zu vermeiden.
- Nach dem Aortotomie geschlossen ist, wird die distale Ligatur entfernt.
- Wenn es keine oder nur geringe Blutungen aus dem reparierten Aortotomie ist der proximale Ligatur entfernt. Die erweiterte Aorta mit Blut füllt sofort.
- Der Darm ist auf den Bauch zurück, und die Wunde in zwei Schichten mit 6-0 Nylon / Polypropylen-Naht verschlossen.
- 0,25% Bupivicaime Tropfen (appx einen Tropfen für jeden Zentimeter des Einschnitts Größe) sind auf der Wunde und eine Dosis von Caprofen platziert (5mg/kg) wird subkutan gegeben.
- Die Maus ist an einem warmen Raum gebracht und in der Regel erholt sich innerhalb von 15 Minuten.
Abbildung 1. Repräsentatives Ergebnis der Elastase induzierten AAA.
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Discussion
Frühere Studien haben signifikante viel zu viel Variation in AAA Entwicklung von verschiedenen kommerziellen Elastase Vorbereitungen 3 notiert haben. Daher ist es wichtig, die Produktion viel zu überwachen sowie die entsprechenden Kontrollgruppen haben, um die Fähigkeit der Vorbereitung auf die AAA induzieren Dokument.
Interessant ist, dass die Anfälligkeit für AAA Entwicklung in diesem Modell hängt von der Maus-Stamm gebraucht 3. Die Maus in das aktuelle Video verwendet wird von der C57BL / 6 Stamm, der konsequenten Weiterentwicklung von AAA mit dem beschriebenen Protokoll. Elastase-Konzentration und / oder Inkubationszeit kann angepasst werden, um andere Stämme unterzubringen.
Obwohl die Technik der Erstellung von AAA mit Elastase in Mäusen technisch anspruchsvoll ist, ist es eine wichtige Technik für die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der AAA Bildung und Entwicklung. Praxis und technische Änderungen wurden in einer Erfolgsquote von über 90% in unserem Labor führte. Wir glauben, dass das Video und der dazugehörige Text wird dazu beitragen, die Lernkurve für Labors, die diese Technik nutzen wollen.
Fehlerbehebung
- Die Äste der abdominalen Aorta sollte mit 10-0 Fäden ligiert werden, verhindert Blutungen während der Operation und eine unzureichende Expansion während Elastase Infusion durch auslaufendes.
- Es ist wichtig, eine klare und weite Betätigungsfeld haben. Verwenden Sie daher 6-0 Naht anstelle von Klammern vorübergehend verschließen die Aorta
- Das Lumen der abdominalen Aorta sollte mit Kochsalzlösung zu Thrombosen nach der Operation zu verhindern gelöscht werden.
- Es ist wichtig, dass die Spitze der Hitze konischen PE-10 Röhre werden sollte, um nicht zu verkratzen Endothelschicht nach dem Einlegen glatt.
- Luftblasen im Inneren der Gefäße sollten vermieden werden, wenn die Infusion Elastase als auch bei der Aortotomie geschlossen werden.
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Acknowledgments
(P50 HL083800-03) von der National Institutes of Health: Diese Arbeit wurde der SCCOR gewähren "Mechanismen, Schichtung und Behandlung AAA-Krankheit" unterstützt
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I porcine pancreatic elastase | Reagent | Sigma-Aldrich | E1250 | |
| polyethylene tubing (PE-10) | BD Biosciences | 427400 | ||
| CHANGE-A-TIP | Bovie Medical Corporation | 18010-00 (FST) | cautery knife | |
| LEICA MZ6 | Leica Microsystems | stereomicroscope | ||
| LEICA DFC290HD | Leica Microsystems | USB camera | ||
| Image Pro Express ver. 6.0 | Media Cybernetics Inc. | software |
References
- Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).
- Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).
- Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).
