Summary
Крупномасштабные иммунодетекции белков-мишеней по всей мозга приматов можно, используя новые ткани вложения и секционирования методами в сочетании с использованием творческого аппарата для пакетной окрашивание нескольких свободно плавающих участков на данный момент времени.
Abstract
Иммуногистохимии (IHC) является одним из наиболее широко используемых лабораторных методов для выявления белков-мишеней
Protocol
Immunohistochemisty является одним из наиболее широко используемых методов для характеристики экспрессии белка в мозге различных экспериментальных моделях на животных. Это сравнительно легко проводить систематические иммуногистохимического процедур на мозг грызунов и других общих экспериментальных моделей с аналогичными размера головного мозга. Тем не менее, нет никаких опубликованных работ, насколько нам известно, что обеспечивает всесторонний отчет о том, как проводить такие процедуры иммунодетекции через весь мозг обезьяны. Далее следует подробное описание, как подготовить весь мозг обезьяны для крупномасштабных иммуногистохимического выявления различных белков цели. Эта работа стала результатом сотрудничества между коммерческими и академическими начинаниях. Таким образом, деталей, относящихся к ткани вложения и секционирования остаются собственные знания о национальной безопасности.
Часть 1: лечение животных и подготовки ткани
Мозг от взрослой обезьяны vervet (Cercopithecus aethiops) используется для настоящего протокола. Все процедуры проводятся в соответствии с Канадским советом по уходу животных (CCAC) руководящие принципы для использования и ухода за животными в биомедицинских исследованиях 1.
- Животное глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS пока полностью обескровлены.
- Далее следуют 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр).
- Вовне мозг находится в градуированной PBS-буфере сахароза решений (10, 20 и 30%, в последовательности), содержащий 0,02% азида натрия и выдерживают при 4 ˚ С до мозга опускается на дно контейнера. Решение менять каждые несколько дней, пока мозг подвергается замораживанию-срезов.
- Мозг направлен Neuroscience Associates (NSA; Ноксвилл, штат Теннесси), которые будут подвергаться их собственной MultiBrain ™ вложения и замораживания срезов технологии.
- Семь (7) выравнивание ориентиры помещаются в матрицу вложение, так что секции могут быть ориентированы должным образом (то есть, право-левой ориентации) и реорганизовывались после гистологического завершения обработки.
- Замороженный блок цифровой сфотографироваться на блоке лицо перед каждым серийным разделе собирается из блоков. Цифровые изображения, а также разделы из этого мозга в дальнейшем может быть использована для 3D реконструкция анатомических и гистологических карт, соответственно.
- Последовательный свободно плавающего корональные разделы, при толщине 50 мкм в разделе, собраны со всего мозга.
Часть 2: Гистологическая обработка
Разделы выбираются в данный пространственный интервал (например, 500-мкм) и для наших экспериментальных целях были обработаны следующие антитела: хрупкой Х-психической отсталостью белка (FMRP; Chemicon; Темекула, Калифорния), SMI32 (Sternberger моноклональных Инк; Балтимор, Мэриленд), а Neun (Chemicon; Темекула, Калифорния). FMRP является цитоплазматический белок, который содержится в изобилии нейронов нормальных и перестановки мозги перевозчика 2. Neun (нейронов ядра) прямо признается ДНК-связывающим нейрон-специфического белка Neun, которая присутствует в большинстве нейронов и распространяется в нейронных ядер, perikarya и некоторые проксимальных нейронных процессов 3. SMI-32 представляет собой моноклональное антитело, которое распознает, не фосфорилированных эпитопом на нейрофиламентов белки 4.
- В интервале 500 мкм, около 140 разделов используются на антитела.
- Все инкубации, моет и окрашивания шаги осуществляются с мягкой агитации с использованием специализированных блюд окрашивания и корзин (HistoTools; Ноксвилл, штат Теннесси).
- Разделы сначала инкубировали в растворе, содержащем 0,1 М PBS/0.3% Тритон Х-100 (TX) / 5% нормальных хриплым сыворотки (NHS) в течение 60 мин с целью уменьшения неспецифического связывания молекул антител и в результате окрашивания фона.
- Разделы помеченные для FMRP иммуноокрашивания пройти дополнительный этап антиген восстановления с помощью антигена Разоблачение Решение (Vector Labs; Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями производителя.
- Разделы затем инкубировали в течение ночи, а в отдельные дни в своих решениях антител, содержащего 0,1 М PBS/0.3% TX / 3% NHS (с коэффициент разбавления 1 / 5, 000 для FMRP и SMI-32 и 1 / 2, 000 на антитела Neun.
- На следующий день, секции промывали три 10-мин периодов в моющем растворе (0,1 М PBS/0.3% TX) с последующей инкубацией в течение 2 ч при комнатной температуре в биотинилированного антимышиным вторичными антителами, поднятых в лошадь (Vector Labs; 1 / 1000 растворения в 0,1 М PBS/0.3% TX / 3% NHS).
- После дальнейшего набор из 3 10-минутных промывок разделов помещаются в решении авидин-биотин сопряженных пероксидазой хрена комплекса (Vector Labs) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Наконец, после очередного набора моет, разделы подвергаются в течение 10 мин для никеля расширенной диаminobenzidine (Ni-DAB) реакция, которая производит синие пятна в иммунореактивного нейронов.
- По завершении процедуры гистологические, разделы монтируются на желатин покрытием слайды стекло.
- Все разделы сушат на воздухе в течение ночи и coverslipped в соответствии со стандартными процедурами.
Часть 3: Представитель Результаты:
Этот метод дает полный профиль экспрессии целевого белка интереса через весь мозг обезьяны. Здесь мы показываем, представитель корональные разделы, которые дают представление о FMRP, Neun и SMI32 выражение в том же мозг обезьяны.
Рисунок 1: Окрашивание блюдо () и корзины (B), используемые для крупномасштабных пакетной обработки свободно плавающего разделы для иммунодетекции.
Рисунок 2: Представитель корональные разделы vervet мозга обезьяны окрашивают в течение FMRP (А), Neun (Б) и SMI32 (C) антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть два важных шагов в этой процедуре, которые делают крупномасштабные обнаружения белков в весь мозг обезьяны возможно. Одним из них является вложение и секционирования протокол, который остается собственностью знание АНБ. Другое использование окрашивания блюд и корзины предоставляемые HistoTools. Последний позволяет легко и быстрого обращения многих (~ 40) разделы на данный момент времени. Он также предоставляет средства для лечения равномерно все секции через мозг и делает для научно обоснованного гистологической обработки. Кроме того, использование встроенных ориентиров обеспечивает дополнительное преимущество, которое позволяет приобрести цифровую окрашивания моделей из высушенных и coverslipped слайды и подвергать оцифрованных файлов в различные формы анализа. Хотя мы приводим примеры из трех антител, эта процедура может быть применена к широкому кругу других белков цель, а также гистологические пятна, особенно тех, которые cytoarchitecture различных участков коры и, следовательно, использоваться для целей картирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Франк Эрвин, Роберта Palmour и сотрудники Фонда поведенческих наук лаборатории расположены в Сент-Китс, Вест-Индии, за их постоянную поддержку нашей работы приматов. Эта работа была поддержана общение с ломкой Х исследовательского фонда Канады (FXRFC) для SZ и - операционной грантов от канадского института исследований в области здравоохранения (АС) и Национальной инженерной и научно-исследовательского совета Канады (МП).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
