Summary
Grande escala imunodetecção de proteínas-alvo em todo o cérebro dos primatas é possível através do emprego de tecido romance incorporação e secção métodos combinados com o uso de aparelhos criativas para a coloração de vários lotes de livre flutuação seções em um determinado momento.
Abstract
Imuno-histoquímica (IHQ) é uma das técnicas de laboratório mais amplamente utilizado para a detecção de proteínas-alvo
Protocol
Immunohistochemisty é uma das técnicas mais utilizadas para caracterizar a expressão da proteína no cérebro de vários modelos animais experimentais. É relativamente fácil de conduzir sistemática procedimentos imuno-histoquímica no cérebro de roedores e outros comuns modelos experimentais com o tamanho do cérebro similar. No entanto, não há trabalhos publicados ao nosso conhecimento que fornece um relato completo de como realizar procedimentos tais imunodetecção através de um cérebro de macaco inteiro. O que se segue é uma descrição detalhada de como preparar um cérebro de macaco inteiro para grande escala de detecção de imuno-histoquímica de proteínas-alvo. Este trabalho surgiu como um resultado da colaboração entre empreendimentos comerciais e acadêmicas. Como tal, os detalhes relativos à incorporação do tecido e corte continuam a ser um conhecimento proprietário da NSA.
Parte 1: tratamento de animais e de preparação dos tecidos
O cérebro de um macaco adulto vervet (Cercopithecus aethiops) é usado para o protocolo atual. Todos os procedimentos são realizados em conformidade com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) Orientações para a utilização e cuidados de animais em pesquisa biomédica 1.
- Animal é profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar.
- Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro).
- O cérebro exterioriza é colocado em classificados soluções PBS-buffered sacarose (10, 20 e 30%, em seqüência) contendo azida sódica 0,02% e mantida a 4 ˚ C até o cérebro se deposita no fundo do recipiente. A solução é substituído a cada poucos dias até que o cérebro passa por congelar corte.
- O cérebro é enviado à neurociência Associates (NSA; Knoxville, TN) para ser submetido aos seus proprietários MultiBrain ™ incorporação e freeze-secção de tecnologia.
- Sete pontos de referência (7) de alinhamento são colocadas na matriz para que a incorporação de seções pode ser orientado corretamente (ou seja, orientação esquerda-direita) e re-alinhados, após processamento histológico está completa.
- O bloco congelado é fotografadas digitalmente o rosto bloco antes de cada seção de série é coletado a partir do bloco. Imagens digitais, bem como secções deste cérebro pode ser usado posteriormente para a reconstrução 3D dos mapas anatômicas e histológicas, respectivamente.
- Serial flutuante cortes coronais, com uma espessura de 50 mm por seção, são coletados de todo o cérebro.
Parte 2: processamento histológico
Seções são escolhidos em um determinado intervalo espacial (por exemplo, 500 mm) e para os nossos fins experimentais foram processados com os anticorpos seguinte:-X frágil proteína retardo mental (FMRP; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger monoclonais Inc.; Baltimore, MD), e NeuN (Chemicon; Temecula, CA). FMRP é uma proteína citoplasmática que abundantemente encontrados nos neurônios do cérebro transportadora normal e permutação 2. NeuN (Núcleos Neuronal) reconhece especificamente o DNA-binding NeuN proteína neurônio-específica que está presente na maioria dos neurônios e é distribuída em núcleos neuronal, perikarya e alguns processos proximal neuronal 3. SMI-32 é um anticorpo monoclonal que reconhece o epítopo não-fosforilado nas proteínas neurofilamento 4.
- Em um intervalo de 500 mm, cerca de 140 seções são usados por anticorpos.
- Todas as incubações, lavagens e as etapas de coloração são realizadas com agitação suave coloração usando pratos especializados e cestas (HistoTools; Knoxville, TN).
- Seções são os primeiros incubados em uma solução contendo 0,1 M Triton PBS/0.3% X-100 (TX) / 5% de soro normais rouca (NHS) para 60 min, a fim de reduzir a ligação inespecífica de moléculas de anticorpos e coloração de fundo resultante.
- Sessão marcada para FMRP imunocoloração passar por uma etapa adicional de recuperação antigênica usando Solução Antígeno Unmasking (Vector Labs, Burlingame, CA) de acordo com instruções do fornecedor.
- As seções são então incubadas durante a noite e em dias separados em suas soluções de anticorpos respectivos contendo 0,1 M PBS/0.3% TX / NHS 3% (com um fator de diluição de 1 / 5, 000 para FMRP e SMI-32 e 1 / 2, 000 para detecção de anticorpos NeuN.
- No dia seguinte, as seções são lavadas por três períodos de 10 min em solução de lavagem (0,1 M TX PBS/0.3%) seguido de incubação por 2 h à temperatura ambiente em anticorpos anti-rato biotinilado secundário cresceu em cavalo (Vector Labs; 1 / 1.000 de diluição em 0,1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%).
- Depois de um conjunto adicional de 3 min 10 lavagens, os cortes são colocados em uma solução de avidina-biotina conjugado peroxidase (Vector Labs) por 1 h em temperatura ambiente.
- Finalmente, depois de um outro conjunto de lavagens, os cortes são submetidos por 10 min para um dia de níquel melhoradaminobenzidine (Ni-DAB) reação que produz uma mancha azul escuro dentro dos neurônios imunorreativos.
- Após a conclusão do procedimento histológico, as seções são montados em lâminas de gelatina revestido de vidro.
- Todas as seções são secas ao ar durante a noite e lamínulas de acordo com os procedimentos padrão.
Parte 3: Resultados Representante:
Este método produz um perfil de expressão completa de uma proteína alvo de interesse através de um cérebro de macaco inteiro. Aqui nós mostramos representante cortes coronais que fornecem um instantâneo da FMRP, NeuN SMI32 e expressão no cérebro do macaco mesmo.
Figura 1: prato de coloração (A) e cesta (B) utilizados para tratamento em grande escala lote de livre flutuação seções para imunodetecção.
Figura 2: Representante cortes coronais de um cérebro de macaco vervet coradas para FMRP (A), NeuN (B) e (C) SMI32 anticorpos.
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Discussion
Existem dois passos críticos a este procedimento que fazer em larga escala de detecção de proteínas em um cérebro de macaco inteiro possível. Um deles é o protocolo de incorporação e de corte, que continua a ser o conhecimento de propriedade da NSA. A outra é a utilização de antenas de coloração e cestas fornecidas pelo HistoTools. Este último permite fácil manuseio e rápida de muitos (~ 40) seções em um determinado momento. Ele também fornece os meios para tratar uniformemente todas as seções em todo o cérebro e faz um tratamento cientificamente histológica. Além disso, o uso de marcos incorporado fornece a vantagem adicional de ser capaz de adquirir digitalmente os padrões de manchas de slides secas e lamínulas e de submeter os arquivos digitalizados a várias formas de análises. Embora nós fornecemos exemplos de três anticorpos, este procedimento pode ser aplicado a uma ampla gama de outras proteínas-alvo, bem como manchas histológico, particularmente aqueles que revelam a citoarquitetura diversas áreas corticais e, portanto, utilizados para fins de mapeamento.
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Acknowledgments
Somos gratos a Frank Ervin, Palmour Roberta e do pessoal das Ciências do Comportamento da Fundação Laboratories localizado em São Cristóvão, West Indies, por seu apoio contínuo do nosso trabalho de primatas. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) para SZ e - subvenções de funcionamento a partir do Canadian Institutes of Health Research (AC) eo Nacional de Engenharia e Research Council of Canada (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
