Summary
على نطاق واسع مناعي للبروتينات المستهدفة في جميع أنحاء الدماغ الرئيسيات كله هو ممكن من خلال استخدام نسيج الرواية أساليب التضمين وsectioning جنبا إلى جنب مع استخدام أجهزة مبتكرة لتلوين مجموعة من المقاطع التعويم الحر متعددة في وقت معين.
Abstract
المناعية (IHC) هي واحدة من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع مختبر للكشف عن البروتينات المستهدفة
Protocol
Immunohistochemisty هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لوصف تعبير البروتين في الدماغ لمختلف النماذج الحيوانية التجريبية. فمن السهل نسبيا لإجراء إجراءات منهجية المناعى على أدمغة الفئران وغيرها من نماذج تجريبية مشتركة مع حجم المخ مماثلة. ومع ذلك ، لا يوجد عمل نشر لمعرفتنا أن يقدم وصفا شاملا لكيفية تنفيذ مثل هذه الإجراءات مناعي عبر الدماغ قرد بأكمله. فيما يلي وصفا مفصلا لكيفية إعداد والقرد الدماغ كله على نطاق واسع كشف المناعى للبروتينات المستهدفة المختلفة. وقد برز هذا العمل نتيجة للتعاون بين المساعي التجارية والأكاديمية. على هذا النحو ، والتفاصيل المتعلقة الأنسجة والتضمين sectioning تبقى معرفة الشخصية من وكالة الامن القومي.
الجزء 1 : معاملة الحيوان ، وإعداد الأنسجة
ويستخدم الدماغ من القرد الفرفت الكبار (القردوح aethiops) لهذا البروتوكول. تنفذ جميع الإجراءات في الامتثال للمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) مبادئ توجيهية لاستخدام ورعاية الحيوانات في البحوث الطبية الحيوية 1.
- هو الحيوان مخدرا عميق مع هيدروكلوريد الكيتامين (10 ملغم / كغم ، IM) ، الموت الرحيم مع جرعة زائدة من الصوديوم و(25 ملغم / كغم ، والرابع) بنتوباربيتال perfused transcardially مع PBS 0،1 M حتى exsanguinated تماما.
- ويعقب ذلك من خلال حل بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق (~ 1 ليتر).
- يتم وضع الدماغ تخريجها في حلول السكروز متدرج PBS - مخزنة (10 و 20 و 30 ٪ ، في تسلسل) التي تحتوي على أزيد الصوديوم 0.02 ٪ وحافظت على 4 ˚ C حتى الدماغ المصارف إلى قاع الإناء. يتم استبدال حل كل بضعة أيام حتى الدماغ يخضع لتجميد sectioning.
- يتم إرسالها إلى المخ المنتسبين علم الأعصاب (NSA ؛ نوكسفيل ، تينيسي) لإخضاعهم للملكية الخاصة MultiBrain ™ التضمين وتجميد sectioning التكنولوجيا.
- وضعت سبعة معالم المحاذاة (7) في المصفوفة التضمين بحيث يمكن التوجه المقاطع بشكل صحيح (أي بين اليمين واليسار التوجه) وإعادة الانحياز بعد اكتمال تجهيز النسيجية.
- يتم تصويرها رقميا كتلة المجمدة في مواجهة كتلة التي يتم جمعها من قبل كل قسم من كتلة تسلسلي. ويمكن في وقت لاحق الصور الرقمية ، وكذلك مقاطع من هذا الدماغ يمكن أن تستخدم لإعادة الإعمار 3D للخرائط التشريحية والنسيجية ، على التوالي.
- المسلسل التعويم الحر أقسام الاكليلية ، في سماكة 50 ميكرون في القسم ، والتي تم جمعها من الدماغ كله.
الجزء 2 : معالجة نسيجية
ويتم اختيار الفروع في الفترة مكانية معينة (على سبيل المثال ، 500 ميكرون) ، ولأغراض تجريبية تم تجهيزها لدينا مع الأضداد التالية : البروتين الهشة العاشر التخلف العقلي (FMRP ؛ Chemicon ؛ تيميكولا ، كاليفورنيا) ، SMI32 (Sternberger Monoclonals شركة ؛ بالتيمور ، ماريلاند) ، وNeuN (Chemicon ؛ تيميكولا ، كاليفورنيا). FMRP هو بروتين حشوية التي وجدت بكثرة في الخلايا العصبية في أدمغة الناقل العادي والتقليب 2. NeuN (أنوية متعلق بالخلايا العصبية) يعترف الحمض النووي على وجه التحديد الملزم NeuN بروتين الخلايا العصبية الخاصة التي هي موجودة في معظم الخلايا العصبية ، ويتم توزيعها في نوى الخلايا العصبية ، وبعض العمليات perikarya القريبة العصبية 3. SMI - 32 هو ريتوكسيماب تعترف حاتمة غير فسفرته على البروتينات neurofilament 4.
- في الفترة الفاصلة من 500 ميكرون ، وتستخدم ما يقرب من 140 في أقسام الأضداد.
- تنفذ جميع حضانات ، ويغسل والخطوات تلطيخ خارجا مع الانفعالات معتدل باستخدام الأطباق والسلال تلطيخ المتخصصة (HistoTools ؛ نوكسفيل ، تينيسي).
- يتم تحضين first المقاطع في محلول يحتوي على 0.1 ٪ M تريتون PBS/0.3 X - 100 (تكساس) / 5 ٪ أجش المصل العادي (NHS) لمدة 60 دقيقة من أجل خفض ملزم غير محدد من جزيئات الأجسام المضادة والناتجة تلوين الخلفية.
- المقاطع علامة للخضوع FMRP immunostaining خطوة إضافية للانتعاش مستضد باستخدام مستضد الحل خلع القناع (ناقلات مختبرات ؛ بورلنجام ، كاليفورنيا) وفقا لتعليمات البائع.
- يتم تحضين ثم المقاطع بين عشية وضحاها في أيام منفصلة في حلولها الضد منها تحتوي على 0.1 م PBS/0.3 ٪ TX / NHS 3 ٪ (مع عامل تخفيف من 000 ، 1 / 5 لFMRP وSMI - 32 و 1 / 2 ، 000 للأضداد NeuN.
- في اليوم التالي ، يتم غسلها المقاطع لفترات 10 دقيقة ثلاثة في حل الغسيل (0.1 M TX PBS/0.3 ٪) تليها الحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الأضداد المضادة للماوس biotinylated الثانوية التي أثيرت في الحصان (ناقلات مختبرات ؛ 1 / 1000 التخفيف في 0.1 ٪ M NHS PBS/0.3 TX / 3 ٪).
- بعد مجموعة أخرى من يغسل 10 3 دقيقة ، يتم وضع المقاطع في حل أفيدين البيوتين ، مترافق معقدة بيروكسيداز الفجل (مختبرات المتجهات) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- أخيرا ، وبعد مجموعة أخرى من يغسل ، التي يتعرض لها أبواب لمدة 10 دقيقة لتعزيز ديا النيكلminobenzidine (ني DAB) والتي تنتج رد فعل زرقاء داكنة وصمة عار داخل الخلايا العصبية مناعيا.
- عند الانتهاء من إجراء النسيجي ، هي التي شنت على الشرائح الزجاجية الأبواب المغلفة الجيلاتين.
- جميع أقسام هي الهواء المجفف بين عشية وضحاها وcoverslipped فقا للاجراءات المتبعة.
الجزء 3 : النتائج الممثل :
هذا الأسلوب ينتج ملف التعبير الكامل للبروتين الهدف من الاهتمام عبر دماغ القرد بأكمله. هنا نعرض الاكليلية ممثل المقاطع التي توفر لقطة من FMRP ، NeuN SMI32 والتعبير في دماغ القرد نفسه.
الشكل 1 : صحن يلطخ (A) وسلة (B) تستخدم لتجهيز دفعة واسعة النطاق من التعويم الحر أقسام للمناعي.
الشكل 2 : أقسام الاكليلية الممثل من دماغ القرد الفرفت الملون لFMRP (A) ، NeuN (B) والأجسام المضادة SMI32 (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء التي تجعل نطاق واسع الكشف عن البروتينات في الدماغ بأكمله قرد ممكن. واحد هو بروتوكول التضمين وsectioning ، التي لا تزال المعرفة الشخصية من وكالة الامن القومي. والآخر هو استخدام الأطباق والسلال تلطيخ HistoTools التي تقدمها. هذا الأخير يسمح لمعالجة سهلة وسريعة لأقسام (~ 40) كثيرة في وقت معين. كما يوفر وسيلة لعلاج منتظم عبر جميع أجزاء الدماغ ويجعل لمعالجة علمية سليمة النسيجية. بالإضافة إلى ذلك ، استخدام جزءا لا يتجزأ من معالم يوفر ميزة إضافية تتمثل في أن تكون قادرة على اكتساب أنماط تلطيخ رقميا من الشرائح المجففة وcoverslipped وإخضاع الملفات الرقمية لأشكال مختلفة من التحليلات. على الرغم من أننا تقديم أمثلة لثلاثة أجسام مضادة ، يمكن تطبيق هذا الإجراء على مجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة الأخرى ، فضلا عن البقع النسيجية ، ولا سيما تلك التي تكشف عن التهندس الخلوي المناطق القشرية المختلفة ، وبالتالي استخدامها لأغراض رسم الخرائط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لارفين فرانك ، Palmour روبرتا وموظفي مختبرات العلوم السلوكية مؤسسة تقع في سانت كيتس وجزر الهند الغربية ، على دعمهم المستمر لعملنا الرئيسيات. وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة البحوث الهشة العاشر من كندا (FXRFC) لSZ و-- المنح التي تعمل من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (ميلان) والهندسة ومجلس البحوث الوطني في كندا (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
