Summary
Su larga scala immunolocalizzazione di proteine bersaglio attraverso tutto il cervello dei primati è possibile utilizzando tessuti romanzo di inclusione e di sezionamento metodi combinati con l'impiego di attrezzature creativo per la colorazione in batch di più liberamente fluttuanti sezioni in un dato momento.
Abstract
Immunoistochimica (IHC) è una delle tecniche di laboratorio più utilizzato per la rilevazione di proteine bersaglio
Protocol
Immunohistochemisty è una delle tecniche più utilizzate per la caratterizzazione di espressione della proteina nel cervello di vari modelli sperimentali animali. E 'relativamente facile da condurre sistematiche procedure di immunoistochimica sul cervello di roditori e di altri comuni modelli sperimentali con le dimensioni del cervello simili. Tuttavia, non c'è lavoro pubblicato a nostra conoscenza, che fornisce un resoconto completo di come svolgere le procedure di immunolocalizzazione tale attraverso un intero cervello della scimmia. Quello che segue è una descrizione dettagliata di come preparare un intero cervello di scimmia per la grande rivelazione immunoistochimica di proteine target diversi. Questo lavoro è emerso come un risultato della collaborazione tra sforzi commerciali e accademici. Come tale, i dettagli relativi al tessuto embedding e sezionamento rimangono una conoscenza di proprietà di NSA.
Parte 1: trattamento degli animali e di preparazione dei tessuti
Il cervello di una scimmia adulta cercopiteco (Cercopithecus aethiops) è utilizzato per il protocollo attuale. Tutte le procedure vengono eseguite nel rispetto della Canadian Council sulla cura degli animali (CCAC) le linee guida per l'uso e la cura degli animali nella ricerca biomedica 1.
- Animale è profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato.
- Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro).
- Il cervello esternato è posto in graduato PBS-buffered soluzioni di saccarosio (10, 20 e 30%, in sequenza) che contiene sodio azide 0,02% e mantenuto a 4 ˚ C fino a quando il cervello scende sul fondo del contenitore. La soluzione è sostituita ogni pochi giorni fino a quando il cervello subisce congelamento sezionamento.
- Il cervello viene inviato agli associati Neuroscienze (NSA, Knoxville, TN) da sottoporre ai loro proprietari MultiBrain ™ inclusione e di gelo-sezionamento della tecnologia.
- Sette (7) punti di riferimento di allineamento vengono inseriti nella matrice embedding in modo che le sezioni possono essere orientati correttamente (vale a dire, sinistra-destra di orientamento) e ri-allineato dopo l'elaborazione istologica è completa.
- Il blocco congelato è fotografato digitalmente il volto blocco prima di ogni sezione seriale viene raccolto dal blocco. Le immagini digitali così come sezioni da questo cervello può essere utilizzato successivamente per la ricostruzione 3D delle mappe anatomiche ed istologiche, rispettivamente.
- Seriale sezioni coronali libero di fluttuare in uno spessore di 50 micron per sezione, sono raccolti presso l'intero cervello.
Parte 2: elaborazione istologica
Le sezioni sono scelti in un dato intervallo spaziale (per esempio, 500-micron) e per i nostri scopi sperimentali sono stati elaborati con i seguenti anticorpi:-X fragile proteina ritardo mentale (FMRP; Chemicon, Temecula, CA), SMI32 (Sternberger monoclonali Inc.; Baltimore, MD), e NeuN (Chemicon, Temecula, CA). FMRP è una proteina citoplasmatica che trovano abbondantemente nei neuroni del cervello vettore normale e permutazione 2. NeuN (Nuclei neuronale) riconosce espressamente il legame al DNA dei neuroni specifici NeuN proteina che è presente nella maggior parte dei neuroni e si distribuisce nei nuclei neuronali, perikarya e alcuni processi neuronali prossimale 3. SMI-32 è un anticorpo monoclonale che riconosce la non-fosforilata epitopo su proteine neurofilamenti 4.
- Ad un intervallo di 500 micron, circa 140 sezioni vengono utilizzati per anticorpi.
- Tutti, lava incubazioni e passi colorazione sono svolte con agitazione mite grazie ad antenne colorazione specializzati e canestri (HistoTools, Knoxville, TN).
- Le sezioni sono prima incubate in una soluzione contenente 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% di siero normale roca (SSN) per 60 minuti al fine di ridurre legame aspecifico di molecole di anticorpi e la colorazione di fondo che ne derivano.
- Le sezioni contrassegnate per immunocolorazione FMRP subire un ulteriore passo di recupero dell'antigene utilizzando Unmasking Solution Antigen (Labs Vector, Burlingame, CA) secondo le istruzioni del fornitore.
- Le sezioni sono poi incubate durante la notte e in giorni distinti nelle loro soluzioni di anticorpi rispettivi contenente 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS (con un fattore di diluizione di 1 / 5, 000 per FMRP e SMI-32 e 1 / 2, 000 per gli anticorpi NeuN.
- Il giorno successivo, le sezioni vengono lavate per tre periodi di 10 minuti in soluzione di lavaggio (0,1 M PBS/0.3% TX), seguita da incubazione per 2 ore a temperatura ambiente in biotinilato anti-topo secondario cresciuto a cavallo (Vector Labs, 1 / 1.000 diluizione in 0,1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%).
- Dopo un ulteriore insieme di 3 10 minuti lava, le sezioni sono poste in una soluzione di avidina-biotina coniugato complesso perossidasi (Vector Labs) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Infine, dopo un'altra serie di lavaggi, le sezioni sono sottoposti per 10 min fino ad un diametro maggiore di nichelminobenzidine (Ni-DAB), reazione che produce una macchia blu scuro all'interno dei neuroni immunoreattive.
- Al completamento della procedura istologici, le sezioni sono montati su gelatina rivestita vetrini.
- Tutte le sezioni sono dotate di aria secca durante la notte e coperti secondo le procedure standard.
Parte 3: Risultati Rappresentante:
Questo metodo produce un profilo completo espressione di una proteina bersaglio di interesse in tutta l'intero cervello della scimmia. Qui vi mostriamo rappresentante sezioni coronali che forniscono un'istantanea di FMRP, NeuN e SMI32 espressione nel cervello della scimmia stessa.
Figura 1: piatto di colorazione (A) e basket (B), utilizzato su larga scala l'elaborazione in batch di free-floating sezioni per immunolocalizzazione.
Figura 2: Rappresentante sezioni coronali da un cervello di scimmia cercopiteco colorate per FMRP (A), NeuN (B) e SMI32 (C) gli anticorpi.
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Discussion
Ci sono due passi fondamentali in questa procedura che rendono grande il rilevamento di proteine in un cervello della scimmia intero possibile. Uno è il protocollo di inclusione e di sezionamento, che rimane la conoscenza di proprietà della NSA. L'altra è l'uso di piatti colorazione e cesti forniti da HistoTools. Quest'ultimo consente di utilizzo semplice e veloce di molti (~ 40) sezioni in un dato momento. Inoltre fornisce i mezzi per trattare in modo uniforme tutte le sezioni in tutto il cervello e fa per un trattamento scientificamente suono istologici. Inoltre, l'uso di punti di riferimento incorporato offre il vantaggio aggiunto di essere in grado di acquisire digitalmente ai modelli di marcatura da diapositive essiccate e coperti e di sottoporre i file digitalizzati a varie forme di analisi. Anche se ci forniscono esempi di tre anticorpi, questa procedura può essere applicata a una vasta gamma di altre proteine bersaglio così come le macchie istologiche, in particolare quelli che rivelano le aree corticali citoarchitettura diversi e, quindi, utilizzato per scopi di mappatura.
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Acknowledgments
Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale delle scienze comportamentali Laboratori Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) a SZ e - sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (AC) e il National Engineering and Research Council del Canada (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
