Summary
A gran escala inmunodetección de las proteínas diana a través del cerebro de los primates todo es posible mediante el empleo de tejidos novedosos métodos de inclusión y corte en combinación con el uso de aparatos creativas para la tinción de lotes de varias secciones de flotación libre en un momento dado.
Abstract
Inmunohistoquímica (IHC) es una de las técnicas de laboratorio más utilizados para la detección de proteínas diana
Protocol
Inmunohistoquímica es una de las técnicas más utilizadas para la caracterización de la expresión de proteínas en el cerebro de los diversos modelos de experimentación animal. Es relativamente fácil de llevar a cabo procedimientos sistemáticos de inmunohistoquímica en el cerebro de los roedores y otros modelos experimentales común con el tamaño del cerebro similar. Sin embargo, no hay ningún trabajo publicado en nuestro conocimiento que proporciona una explicación detallada de cómo llevar a cabo dichos procedimientos de inmunodetección a través de un cerebro de mono entero. Lo que sigue es una descripción detallada de cómo preparar un cerebro del mono todo a gran escala la detección inmunohistoquímica de las proteínas diana. Este trabajo ha surgido como resultado de la colaboración entre las actividades comerciales y académicas. Por lo tanto, los detalles relativos a los tejidos inclusión y corte sigue siendo un conocimiento de su propiedad de la NSA.
Parte 1: El tratamiento de los animales y la preparación del tejido
El cerebro de un adulto mono verde (Cercopithecus aethiops) se utiliza para el presente Protocolo. Todos los procedimientos se llevan a cabo de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) Directrices para el uso y cuidado de los animales en la investigación biomédica 1.
- Animal está profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado.
- Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro).
- El cerebro se coloca en externalizados calificado soluciones de sacarosa PBS buffer (10, 20 y 30%, en la secuencia), que contiene 0,02% de ácido sódico y se mantiene a 4 ˚ C hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del recipiente. La solución es reemplazado cada pocos días hasta que el cerebro sufre congelación y corte.
- El cerebro se envía a los Asociados de la neurociencia (NSA, Knoxville, TN) para ser sometido a su propia MultiBrain ™ inclusión y de congelación y corte la tecnología.
- Siete (7) puntos de referencia de alineación se colocan en la matriz de incrustación para que las secciones se pueden orientar adecuadamente (es decir, de izquierda a derecha orientación) y re-alineados tras el procesamiento histológico se ha completado.
- El bloque congelado es fotografiados digitalmente en la cara del bloque antes de cada sección de serie se obtiene de la manzana. Las imágenes digitales, así como las secciones de este cerebro puede ser utilizada después para la reconstrucción 3D de los mapas anatómicos e histológicos, respectivamente.
- Serie de libre flotación secciones coronal, con un espesor de 50 micras por cada sección, se obtienen de todo el cerebro.
Parte 2: procesamiento histológico
Las secciones son elegidos en un determinado intervalo espacial (por ejemplo, de 500 micras) y para nuestros propósitos experimentales se procesaron con los siguientes anticuerpos: X frágil retraso mental proteína (FMRP, Chemicon, Temecula, CA), SMI32 (Sternberger monoclonales Inc.; Baltimore, MD), y NeuN (Chemicon, Temecula, CA). FMRP es una proteína citoplasmática que encuentra en abundancia en las neuronas de los cerebros de transporte normal y permutación 2. NeuN (núcleos neuronales) reconoce específicamente la unión al ADN específica de neuronas NeuN proteína que está presente en la mayoría de las neuronas y se distribuye en núcleos neuronales, perikarya y algunos procesos neuronales proximal 3. SMI-32 es un anticuerpo monoclonal que reconoce el epítopo no fosforilada, el 4 de proteínas de neurofilamentos.
- En un intervalo de 500 m, aproximadamente 140 secciones son utilizadas por anticuerpos.
- Todas las incubaciones, se lava las manchas y los pasos se llevan a cabo con agitación suave con platos especializados manchas y cestas (HistoTools, Knoxville, TN).
- Las secciones se incuban primero en una solución que contiene 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% de suero normal ronca (NHS) durante 60 minutos con el fin de reducir la unión no específica de moléculas de anticuerpos y la tinción de fondo resultante.
- Las secciones marcadas para inmunoticción FMRP someterse a una operación adicional de recuperación de antígenos mediante el uso de solución de antígeno Desenmascarando (Vector Labs, Burlingame, CA) de acuerdo a las instrucciones del proveedor.
- Las secciones se incuban durante la noche y en días distintos en sus soluciones de anticuerpos respectivos que contiene 0,1 M PBS/0.3% TX / NHS 3% (con un factor de dilución de 1 / 5, 000 para FMRP y SMI-32 y 1 / 2, 000 para los anticuerpos NeuN.
- Al día siguiente, las secciones se lavan durante tres períodos de 10 minutos en la solución de lavado (0.1 M PBS/0.3% TX), seguido de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente en biotinilado anti-anticuerpo secundario del ratón se crió en caballo (Vector Labs, 1 / 1000 dilución en 0,1 M PBS/0.3% NHS TX / 3%).
- Después de una nueva serie de 3 a 10 min lavados, las secciones se colocan en una solución de complejo avidina-biotina conjugada con peroxidasa (Vector Labs) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Finalmente, después de otra serie de lavados, las secciones son sometidas durante 10 minutos a un diámetro mayor de níquelminobenzidine (Ni-DAB) la reacción que produce una mancha de color azul oscuro dentro de las neuronas inmunorreactivas.
- Al finalizar el procedimiento histológico, las secciones se montan en placas de vidrio recubiertas de gelatina.
- Todas las secciones se secan al aire durante la noche y coverslipped acuerdo con los procedimientos estándar.
Parte 3: Resultados del representante:
Este método produce un perfil de expresión completa de una proteína diana de interés a través de un cerebro de mono entero. Aquí se muestra representativa secciones coronal que proporcionan una instantánea de la FMRP, NeuN y SMI32 expresión en el cerebro del mono mismo.
Figura 1: Plato de tinción (A) y la cesta (B) utilizados para el procesamiento por lotes a gran escala de libre flotación secciones para la inmunodetección.
Figura 2: Representante de las secciones coronal de un cerebro monos verdes teñidas de FMRP (A), NeuN (B) y los anticuerpos SMI32 (C).
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Discussion
Hay dos pasos fundamentales en este procedimiento que hacen a gran escala de detección de proteínas en el cerebro de un mono completo posible. Uno de ellos es el protocolo de inclusión y corte, que sigue siendo el conocimiento de su propiedad de la NSA. El otro es el uso de platos de tinción y cestas proporcionada por HistoTools. Este último permite un manejo fácil y rápido de muchas (~ 40) secciones en un momento dado. También proporciona los medios para tratar de manera uniforme a todos los sectores a través del cerebro y lo convierte en un tratamiento científicamente histológico de sonido. Además, el uso de puntos de referencia incorporado proporciona la ventaja añadida de ser capaz de adquirir digitalmente los patrones de tinción de portaobjetos y cubreobjetos secos y para someter a los archivos digitalizados a diversas formas de análisis. A pesar de que son ejemplos de tres anticuerpos, este procedimiento se puede aplicar a una amplia gama de proteínas diana, así como otras tinciones histológicas, especialmente las que revelan la citoarquitectura cortical diversas áreas y por lo tanto, utilizarse para fines cartográficos.
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Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Frank Ervin, Palmour Roberta y el personal de Laboratorios de Ciencias de la Conducta fundación con sede en San Cristóbal, de las Indias Occidentales, por su continuo apoyo a nuestro trabajo de primates. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación X Frágil de Investigación de Canadá (FXRFC) a SZ y - subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (AC) y la Nacional de Ingeniería y de Investigación de Canadá (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
