Summary
Tüm primat beyin genelinde hedef proteinlere büyük ölçekli İmmuno gömerek yeni doku istihdam ve belirli bir zamanda birden fazla serbest bölümleri toplu boyama için yaratıcı cihazların kullanımı ile kombine yöntemler kesit mümkündür.
Abstract
Immünhistokimyasal (İHK) hedef proteinlerin tespiti için en yaygın kullanılan laboratuvar teknikleri biridir
Protocol
Immunohistochemisty çeşitli deneysel hayvan modellerinde beyin protein ifade tanımlamak için en yaygın olarak kullanılan tekniklerin biridir. Benzer beyin büyüklüğü ile kemirgenler ve diğer ortak deneysel modeller beyinlerinde sistematik immünohistokimyasal işlemleri yürütmek nispeten kolaydır. Ancak, bütün bir maymun beyin çapında İmmuno prosedürleri yürütmek için nasıl kapsamlı bir hesap sağlar bilgimizi yayınlanmış hiçbir çalışma yoktur. Aşağıda, çeşitli hedef proteinlerin büyük ölçekli immünohistokimyasal tespiti için bütün bir maymun beyni nasıl hazırlamak için ayrıntılı bir açıklama. Bu çalışma, ticari ve akademik çalışmaların arasındaki işbirliğinin bir sonucu olarak ortaya çıkmıştır. Gibi, doku gömme ve kesit ilgili detayları NSA, özel bir bilgi kalır.
Bölüm 1: Hayvan tedavi ve doku hazırlanması
İşbu Protokol, yetişkin bir vervet maymun (cebus aethiops) beynin kullanılır . Tüm işlemler, biyomedikal araştırma 1 hayvanlarının kullanımı ve bakımı için Hayvan Bakım Kanada Konseyi (CCAC) yönergeleri ile uyum içinde yürütülmektedir .
- Hayvan derinden aşırı dozda sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv) ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im) ile sedasyon.
- Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir.
- Dışsallaşmış beyin, beyin kabın dibine lavabolar ˚ C kadar% 0.02 sodyum azid içeren PBS-tamponlu kademeli sakaroz çözümleri (sırayla 10, 20 ve% 30) yerleştirilir ve 4 tutulur. Beyin donma-kesit uğrar kadar çözüm birkaç günde değiştirilir.
- Tescilli MultiBrain tabi ™ gömme ve donma-kesit teknolojisi, beyin Neuroscience Associates (Knoxville NSA) gönderilir.
- Yedi (7) hizalama işaretlerini bölümleri doğru yönde (örneğin, sağ-sol yönlendirme) ve histolojik işlem tamamlandıktan sonra yeniden hizalanmış böylece gömme matris yerleştirilir.
- Dondurulmuş blok, her blok seri bölümünde toplanan önce dijital blok yüzüne fotoğraflandı. Dijital görüntülerin yanı sıra, bu beyin bölümlerinin daha sonra sırasıyla, anatomik ve histolojik haritaları 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan olabilir.
- Seri serbest koronal bölümleri, bölüm başına 50 mikron kalınlığında, tüm beyin toplanır.
Bölüm 2: Histolojik işleme
Bölüm belirli bir mekansal aralıklarla seçilir (örneğin, 500 mikron) ve deneysel amaçlar için aşağıdaki antikorlar ile işlendi: kırılgan-X mental retardasyon protein (FMRP; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals A.Ş.; Baltimore, MD) ve Neun (Chemicon; Temecula, CA). FMRP, bol miktarda normal ve permütasyon taşıyıcı beyinleri nöronlar 2 bulunan bir sitoplazmik bir proteindir. Neun (Nöronal Çekirdekler) özellikle en nöronlarda ve nöron çekirdekleri, perikarya ve proksimal bazı nöronal süreçleri 3 dağıtılır nöron spesifik DNA-bağlayıcı protein Neun tanır. SMI-32 nörofilaman proteinler 4 olmayan fosforile epitop tanıyan bir monoklonal antikor.
- 500 mikron aralığında yaklaşık 140 bölümleri antikor başına kullanılır.
- Tüm inkubasyon, yıkama ve boyama adımları hafif ajitasyon özel boyama yemekleri ve sepetler (Knoxville, TN HistoTools) kullanılarak yapılmaktadır.
- Bölüm ilk antikor moleküllerinin nonspesifik bağlayıcı ve arka plan boyama azaltmak için 0.1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 60 dakika süreyle% 5 normal boğuk serum (NHS) içeren bir çözüm inkübe edilir.
- Üreticisinin talimatlarına göre; immün FMRP işaretli bölümleri Antijen açığa çıkarılması Çözümü (Burlingame, CA Vektör Labs) kullanarak antijen kurtarma ek bir adım uğrarlar.
- Bölüm sonra geceleme ve 0.1 M PBS/0.3% TX /% 3 NHS (Neun antikorlar FMRP ve SMI-32 ve 1 / 2, 000 1 / 5, 000 bir sulandırma faktörü içeren, ilgili antikor çözümler ayrı gün inkübe edilir.
- 1 /; ertesi gün, bölümler üç yıkama solüsyonu oda sıcaklığında 2 saat atı gündeme biotinlenmiş anti-fare sekonder antikoru (Vektör Labs inkübasyon takip 10 dakikalık bir süre (0,1 M PBS/0.3% TX) yıkanır 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS 1000 dilüsyon).
- 3 10 dakika yıkar daha da ayarladıktan sonra, oda sıcaklığında 1 saat süreyle avidin-biotin konjuge horseradish peroksidaz kompleksi (Vektör Labs) bir çözüm bölümleri yerleştirilir.
- Son olarak, başka bir ayarladıktan sonra yıkar, bölümler nikel gelişmiş dia 10 dakika tabi tutulurminobenzidine (Ni-DAB) immunoreaktif nöronların içinde koyu mavi bir leke üretir tepki.
- Histolojik prosedür bitiminde, bölümler, jelatin kaplı cam slaytlar monte edilmiştir.
- Tüm bölümler, hava kuru bir gecede ve standart prosedürlere göre dakika muamele.
Bölüm 3: Temsilcisi Sonuçlar:
Bu yöntem, bütün bir maymun beyin çapında ilgi bir hedef protein tam bir ifade profili üretir. Burada FMRP, Neun ve aynı maymun beyni ifade SMI32 bir anlık sağlamak temsilcisi koronal bölümleri göstermektedir.
Şekil 1: Boyama çanak (A) ve sepet (B) İmmuno için serbest bölümden büyük ölçekli toplu işlem için kullanılır.
Şekil 2: FMRP (A), Neun (B) ve SMI32 (C) antikorları ile boyanan bir vervet maymun beyin Temsilcisi koronal kesitler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mümkün bütün bir maymun beyin proteinlerin büyük ölçekli algılama yapan bu yordamı iki kritik adımlar vardır. Bir NSA özel bilgi kalır gömme ve kesit protokolü. Diğer HistoTools tarafından sağlanan boyama yemekleri ve sepetler. Ikincisi, belirli bir zamanda çok sayıda (~ 40) bölümleri kolay ve hızlı kullanım sağlar. Aynı zamanda beyin genelinde tüm bölümleri düzgün tedavi için gerekli olan araçları sağlar ve bilimsel bir ses histolojik tedavi için yapar. Buna ek olarak, gömülü yerlerinden kullanılması, kurutulmuş ve dakika muamele slaytlar boyanma dijital edinmeleri ve çeşitli şekillerde analiz sayısallaştırılmış dosyalar konu edememek ekledi avantaj sağlar. Biz üç antikorların örnekler sağlasa da, bu yordamı, başta olmak üzere diğer hedef proteinlerin yanı sıra histolojik lekeleri, hücre mimarisini çeşitli kortikal alanları ortaya çıkarmak ve bu nedenle haritalama amaçlı kullanılan bu geniş bir yelpazede uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Frank Ervin, Roberta Palmour ve primat çalışmaları devam eden desteği, Batı Hint Adaları, St Kitts bulunan Davranış Bilimleri Vakfı Laboratuar personeline teşekkür ediyoruz. Kanada Sağlık Araştırmaları (AC) ve Ulusal Mühendislik ve Kanada Araştırma Konseyi (MP) Enstitüleri işletme hibeleri - Bu çalışma Frajil X Araştırma SZ Kanada Vakfı (FXRFC) ve bir burs ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
