Summary
Grootschalige immunodetectie van target eiwitten in het hele primaat hersenen is mogelijk door het gebruik van nieuwe weefsel inbedden en snijden methoden gecombineerd met het gebruik van creatieve apparatuur voor batch kleuring van meerdere vrij zwevende delen op een gegeven moment.
Abstract
Immunohistochemie (IHC) is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor de detectie van doeleiwitten
Protocol
Immunohistochemisty is een van de meest gebruikte technieken voor het karakteriseren van proteïne-expressie in de hersenen van verschillende experimentele diermodellen. Het is relatief eenvoudig om een systematische immunohistochemische procedures te voeren op de hersenen van knaagdieren en andere gemeenschappelijke experimentele modellen met vergelijkbare hersengrootte. Er is echter geen gepubliceerde werk aan onze kennis, dat een volledig overzicht van het uitvoeren van een dergelijke immunodetectie procedures voor een heel aap hersenen zorgt. Wat volgt is een gedetailleerde beschrijving van hoe je een hele aap hersenen voor te bereiden op grootschalige immunohistochemische detectie van verschillende doelwit eiwitten. Dit werk heeft zich ontpopt als een resultaat van de samenwerking tussen commerciële en academische inspanningen. Als zodanig, details met betrekking tot weefsel inbedden en snijden blijft een eigen kennis van de NSA.
Deel 1: Animal behandeling en het prepareren van weefsels
De hersenen van een volwassene vervet aap (Cercopithecus aethiops) wordt gebruikt voor het huidige protocol. Alle procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren in het biomedisch onderzoek 1.
- Dier is diep gesedeerd met ketamine hydrochloride (10 mg / kg, im), gedood met een overdosis natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) en perfusie transcardially met 0,1 M PBS tot het volledig exsanguinated.
- Dit wordt gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing in PBS gedurende 5 minuten (~ 1 liter).
- De geëxternaliseerd brein is geplaatst in gesorteerd PBS-gebufferde sucrose oplossingen (10, 20 en 30%, in volgorde) met 0,02% natriumazide en gehandhaafd op 4 ˚ C tot de hersenen zinkt naar de bodem van de container. De oplossing wordt vervangen om de paar dagen totdat de hersenen ondergaat een freeze-snijden.
- De hersenen wordt verstuurd naar NeuroScience Associates (NSA, Knoxville, TN) te worden onderworpen aan hun eigen MultiBrain ™ inbedding en de freeze-snijden-technologie.
- Zeven (7) alignment oriëntatiepunten zijn geplaatst in de inbedding matrix zodat de onderdelen goed kunnen worden gericht (dat wil zeggen, links-rechts oriëntatie) en opnieuw uitgelijnd nadat histologische verwerking is voltooid.
- Het diepgevroren blok wordt digitaal gefotografeerd op het blok gezicht voor elke seriële sectie is verzameld uit het blok. Digitale beelden, alsmede onder afdelingen van deze hersenen kunnen later gebruikt worden voor de 3D reconstructie van de anatomische en histologische kaarten, respectievelijk.
- Serial free-floating coronale secties, bij een dikte van 50 micrometer per sectie, zijn verzameld uit de hele hersenen.
Deel 2: Histologische verwerking
Secties worden gekozen op een bepaald ruimtelijk interval (bijvoorbeeld 500-um) en voor onze experimentele doeleinden werden verwerkt met de volgende antilichamen: fragiele-X-mentale retardatie eiwit (FMRP, Chemicon, Temecula, CA), SMI32 (Sternberger monoklonalen Inc; Baltimore, MD), en Neun (Chemicon, Temecula, CA). FMRP is een cytoplasmatisch eiwit dat in overvloed te vinden in neuronen van normale en permutatie drager hersenen 2. Neun (Neuronale Kernen) erkent in het bijzonder de DNA-bindende neuron-specifiek eiwit Neun, die aanwezig is in de meeste neuronen en wordt verspreid in neuronale kernen, perikarya en sommige proximale neuronale processen 3. SMI-32 is een monoklonaal antilichaam dat de niet-gefosforyleerd epitoop op neurofilament eiwitten 4 herkent.
- Met een interval van 500 pm, zijn ongeveer 140 secties gebruikt per antilichaam.
- Alle incubaties, wast en vlekken stappen worden uitgevoerd met een lichte agitatie met gespecialiseerde vlekken gerechten en manden (HistoTools, Knoxville, TN).
- Secties worden eerst geïncubeerd in een oplossing met 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% normaal hese serum (NHS) voor 60 min in om niet-specifieke binding van antilichaam-moleculen en de daaruit voortvloeiende achtergrondkleuring te verminderen.
- Secties gemarkeerd voor FMRP immunokleuring ondergaan een extra stap van antigeen herstel door gebruik te maken Antigen ontmaskeren Solution (Vector Labs, Burlingame, CA) volgens de leverancier de instructies.
- Secties worden dan geïncubeerd 's nachts en op verschillende dagen in hun respectieve antilichamen oplossingen die 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS (met een verdunningsfactor van 1 / 5, 000 voor FMRP en SMI-32 en 1 / 2, 000 voor Neun antilichamen.
- De volgende dag, zijn secties gewassen voor drie 10-min perioden in het wassen-oplossing (0,1 M PBS/0.3% TX), gevolgd door incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in gebiotinyleerd anti-muis secundair antilichaam getogen in paarden (Vector Labs, 1 / 1000 verdunning in 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS).
- Na een verdere reeks van drie 10-min wast, worden de secties geplaatst in een oplossing van avidine-biotine geconjugeerd mierikswortelperoxidase complex (Vector Labs) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Eindelijk, na een andere set wast, zijn de secties onderworpen gedurende 10 min tot een verbeterde nikkel-diaminobenzidine (Ni-DAB) reactie die produceert een donkerblauwe vlek binnen immunoreactieve neuronen.
- Bij de voltooiing van de histologische procedure, zijn secties gemonteerd op gelatine-gecoat glas dia's.
- Alle secties zijn voorzien van een nacht lang gedroogd en afgedekt volgens standaard procedures.
Deel 3: representatieve resultaten:
Deze methode levert een volledige expressie profiel van een doelwit eiwit van belang voor een heel aap brein. Hier laten we vertegenwoordiger coronale secties die een momentopname van FMRP, Neun en SMI32 uitdrukking in dezelfde aap hersenen te bieden.
Figuur 1: Kleuroplossing schaaltje (A) en mand (B) die wordt gebruikt voor grootschalige batchverwerking van vrij zwevende secties voor immunodetectie.
Figuur 2: Representatieve coronale secties van een vervet aap hersenen gekleurd voor FMRP (A), Neun (B) en SMI32 (C) antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in deze procedure dat grootschalige detectie van eiwitten in een hele aap hersenen mogelijk te maken. Een daarvan is de inbedding en snijden protocol, dat blijft de eigen kennis van de NSA. De andere is het gebruik van vlekken gerechten en manden door HistoTools. Deze laatste zorgt voor eenvoudige en snelle afhandeling van een groot aantal (~ 40) delen op een bepaald tijdstip. Het biedt ook de middelen voor het behandelen van alle secties gelijkmatig over de hersenen en zorgt voor een wetenschappelijk verantwoorde histologische behandeling. Daarnaast is het gebruik van embedded bezienswaardigheden biedt het extra voordeel van de mogelijkheid om digitaal te verwerven van de kleurpatronen van de gedroogde en afgedekt dia's en om de gedigitaliseerde bestanden onderworpen aan verschillende vormen van analyses. Hoewel we voorbeelden van drie antilichamen, kan deze procedure worden toegepast op een breed scala van andere doeleiwitten evenals histologische vlekken, met name dat de cytoarchitecture verschillende corticale gebieden te onthullen en hence worden gebruikt voor het toewijzen van doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Frank Ervin, Roberta Palmour en het personeel van de Gedragswetenschappen Stichting Laboratoria gevestigd in St. Kitts, West-Indië, voor hun blijvende steun van onze primaat werk. Dit werk werd ondersteund door een beurs van fragiele X Research Foundation of Canada (FXRFC) naar SZ en - exploitatiesubsidies van de Canadese Institutes of Health Research (AC) en de Nationale Engineering en Research Council of Canada (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
