Summary
पूरे रहनुमा मस्तिष्क भर में लक्ष्य प्रोटीन की बड़े पैमाने पर immunodetection उपन्यास ऊतक रोजगार एम्बेडिंग और एक निश्चित समय पर एकाधिक मुक्त अस्थायी वर्गों के बैच धुंधला के लिए रचनात्मक उपकरण के उपयोग के साथ संयुक्त तरीकों सेक्शनिंग द्वारा ही संभव है.
Abstract
Immunohistochemistry (आईएचसी) लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रयोगशाला तकनीकों में से एक है
Protocol
Immunohistochemisty विभिन्न प्रयोगात्मक पशु मॉडल के मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति निस्र्पक के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यह अपेक्षाकृत आसान है करने के लिए इसी तरह की मस्तिष्क के आकार के साथ और rodents और अन्य आम प्रयोगात्मक मॉडल के दिमाग पर व्यवस्थित immunohistochemical प्रक्रियाओं आचरण. हालांकि, वहाँ कोई प्रकाशित हमारे ज्ञान है कि कैसे बाहर ले जाने के लिए एक पूरे बंदर मस्तिष्क भर में इस तरह immunodetection प्रक्रियाओं की एक व्यापक खाते प्रदान करता है के लिए काम है. क्या इस प्रकार कैसे तैयार करने के लिए बड़े पैमाने पर विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन के immunohistochemical पता लगाने के लिए एक पूरे बंदर मस्तिष्क के एक विस्तृत वर्णन है. इस काम के वाणिज्यिक और शैक्षिक प्रयासों के बीच सहयोग का एक परिणाम के के रूप में उभरा है. जैसे, ऊतक एम्बेडिंग और सेक्शनिंग से संबंधित विवरण एनएसए की एक मालिकाना ज्ञान रहते हैं.
भाग 1: पशु उपचार और ऊतकों की तैयारी
एक वयस्क vervet बंदर (Cercopithecus aethiops) से मस्तिष्क वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए प्रयोग किया जाता है. जानवर की देखभाल पर अमेरिकी परिषद (CCAC) और जैव चिकित्सा अनुसंधान 1 में पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए दिशा निर्देशों के साथ अनुपालन में सभी प्रक्रियाओं बाहर किया जाता है.
- पशु गहरा ketamine (10 मिग्रा / किग्रा, IM) हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम pentobarbital (25 मिलीग्राम / किलो, iv) 0.1 एम पीबीएस साथ transcardially perfused जब तक पूरी तरह से exsanguinated और एक ज्यादा के साथ euthanized के साथ बेहोश है.
- यह पीबीएस में 5 मिनट (~ 1 लीटर) के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान द्वारा पीछा किया जाता है.
- externalized मस्तिष्क वर्गीकृत PBS बफर sucrose (10, 20 और 30% अनुक्रम में) समाधान युक्त 0.02% सोडियम azide में रखा गया है और 4 पर बनाए रखा ˚ सी जब तक मस्तिष्क कंटेनर के नीचे डूब. समाधान हर कुछ दिनों की जगह है जब तक मस्तिष्क फ्रीज सेक्शनिंग आए.
- उनके स्वामित्व MultiBrain के अधीन किया जा ™ एम्बेडिंग और फ्रीज सेक्शनिंग प्रौद्योगिकी, मस्तिष्क तंत्रिका विज्ञान एसोसिएट्स (Knoxville, TN एनएसए) के लिए भेजा जाता है.
- सात (7) संरेखण स्थलों एम्बेड मैट्रिक्स में रखा जाता है इतना है कि वर्गों उन्मुख होना ठीक से कर सकते हैं (यानी, बाएँ - दाएँ ओरिएंटेशन) और फिर गठबंधन histological प्रसंस्करण के बाद पूरा हो गया है.
- जमी ब्लॉक डिजिटल ब्लॉक चेहरे पर फोटो खिंचवाने से पहले प्रत्येक धारावाहिक अनुभाग ब्लॉक से एकत्र किया जाता है. डिजिटल छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस दिमाग से वर्गों बाद में संरचनात्मक और histological नक्शे के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सकता है, क्रमशः.
- सीरियल मुक्त अस्थायी राज्याभिषेक वर्गों, अनुभाग प्रति 50 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई पर, पूरे दिमाग से एकत्र कर रहे हैं.
भाग 2: histological प्रसंस्करण
धारा एक दिया स्थानिक अंतराल पर चुना जाता है (उदाहरण के लिए, 500-सुक्ष्ममापी) और निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ हमारे प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए प्रोसेस किया गया: नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन (FMRP, Chemicon, Temecula, सीए), SMI32 (Sternberger Monoclonals इंक; बाल्टीमोर, एमडी), और NeuN (Chemicon, Temecula, CA). FMRP एक cytoplasmic प्रोटीन है कि सामान्य और क्रमचय वाहक दिमाग के न्यूरॉन्स 2 में बहुतायत से पाया है. NeuN (Neuronal नाभिक) विशेष रूप से डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन न्यूरॉन विशेष NeuN जो सबसे न्यूरॉन्स में मौजूद है और neuronal नाभिक, perikarya और कुछ प्रॉक्सिमल neuronal 3 प्रक्रियाओं में वितरित की है पहचानता है. SMI-32 एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि गैर phosphorylated neurofilament 4 प्रोटीन पर मिलान पहचानता है.
- 500 सुक्ष्ममापी के अंतराल में, लगभग 140 वर्गों एंटीबॉडी के प्रति किया जाता है.
- सभी incubations washes, और धुंधला कदम हल्के आंदोलन के साथ विशेष धुंधला व्यंजन और टोकरियाँ (, Knoxville, TN HistoTools) का उपयोग किया जाता है.
- अनुभाग पहले 0.1 एम PBS/0.3% X-100 ट्राइटन (TX) / क्रम में एंटीबॉडी अणुओं की nonspecific बंधन और जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि धुंधला को कम 5% 60 मिनट के लिए सामान्य कर्कश सीरम (एनएचएस) से युक्त समाधान में incubated हैं.
- विक्रेता निर्देशों के अनुसार, FMRP के लिए चिह्नित immunostaining धारा एंटीजन अनमास्किंग समाधान (Burlingame, CA वेक्टर लैब्स) का उपयोग करके प्रतिजन वसूली के एक अतिरिक्त कदम से गुजरना.
- धारा तो रातोंरात और उनके संबंधित एंटीबॉडी 0.1 एम PBS/0.3% TX / 3% एन एच एस (NeuN एंटीबॉडी के लिए एक 1 / 5, FMRP और SMI-32 और 1 / 2, 000 के लिए 000 के कमजोर पड़ने कारक के साथ युक्त समाधान में अलग दिनों पर incubated हैं.
- 1 /, अगले दिन, अनुभागों तीन वाशिंग समाधान में 10 मिनट की अवधि (0.1 एम PBS/0.3% TX) biotinylated विरोधी माउस माध्यमिक घोड़े में उठाया एंटीबॉडी में कमरे के तापमान पर 2 घंटे (वेक्टर लैब्स के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा के लिए धो रहे हैं 0.1 एम PBS/0.3% TX / 3% एनएचएस में 1,000 मन्दन).
- तीन 10 मिनट washes के एक और सेट के बाद, अनुभागों avidin बायोटिन कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए संयुग्मित हॉर्सरैडिश peroxidase परिसर (वेक्टर लैब्स) का एक समाधान में रखा जाता है.
- अंत में, washes के एक सेट के बाद वर्गों को 10 मिनट के लिए एक निकल बढ़ाया व्यास अधीन हैंminobenzidine (नी-थपका) प्रतिक्रिया है जो उत्पादन immunoreactive न्यूरॉन्स के भीतर एक गहरे नीले दाग.
- Histological प्रक्रिया के पूरा होने पर, अनुभाग जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड पर बढ़ रहे हैं.
- सभी वर्गों रात भर हवा सूखे हैं और मानक प्रक्रियाओं के लिए अनुसार coverslipped.
भाग 3: प्रतिनिधि परिणाम:
यह विधि एक पूरे बंदर मस्तिष्क भर में ब्याज की एक लक्ष्य प्रोटीन की एक पूरी अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का उत्पादन. यहाँ हम प्रतिनिधि राज्याभिषेक वर्गों है कि FMRP, NeuN और एक ही बंदर के मस्तिष्क में SMI32 अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट प्रदान करते दिखाते हैं.
चित्रा 1: (ए) धुंधला डिश और टोकरी (बी) immunodetection के लिए मुक्त अस्थायी वर्गों के बड़े पैमाने पर बैच प्रोसेसिंग के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2: एक vervet बंदर (A) FMRP, NeuN (बी) और SMI32 एंटीबॉडी (सी) के लिए दाग मस्तिष्क से प्रतिनिधि राज्याभिषेक वर्गों .
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Discussion
इस प्रक्रिया में दो महत्वपूर्ण कदम है कि एक पूरे बंदर संभव मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर प्रोटीन का पता लगाने के हैं. एक एम्बेड और सेक्शनिंग प्रोटोकॉल, जो एनएसए के स्वामित्व ज्ञान रहता है. अन्य धुंधला व्यंजन और HistoTools द्वारा प्रदान की टोकरी का उपयोग है. बाद एक निश्चित समय पर कई वर्गों (~ 40) के आसान और जल्दी से निपटने के लिए अनुमति देता है. यह भी समान मस्तिष्क भर में सभी वर्गों के इलाज के लिए साधन प्रदान करता है और एक वैज्ञानिक ध्वनि histological इलाज के लिए बनाता है. इसके अलावा, एम्बेडेड स्थलों का उपयोग सूखे और coverslipped स्लाइड्स से धुंधला पैटर्न को डिजिटल अधिग्रहण और विश्लेषण के विभिन्न रूपों डिजीटल फाइलें विषय में सक्षम किया जा रहा का जोड़ा लाभ प्रदान करता है. हालांकि हम तीन एंटीबॉडी के उदाहरण देते हैं, तो इस कार्यविधि अन्य लक्ष्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन histological दाग, विशेष रूप से उन है कि cytoarchitecture विभिन्न cortical क्षेत्रों से पता चलता है और इसलिए मानचित्रण प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है.
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Acknowledgments
हम फ्रैंक Ervin, रोबर्टा Palmour और व्यवहार विज्ञान फाउंडेशन हमारे रहनुमा काम के अपने निरंतर समर्थन के लिए, वेस्ट इंडीज, सेंट किट्स में स्थित प्रयोगशालाओं के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं. स्वास्थ्य अनुसंधान (एसी) और राष्ट्रीय इंजीनियरिंग और अनुसंधान परिषद के कनाडा (सांसद) की कनाडा के संस्थानों से ऑपरेटिंग अनुदान - यह काम नाजुक एक्स कनाडा की रिसर्च फाउंडेशन (FXRFC) SZ करने के लिए और से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
