Summary
Storskalig immunodetection av målproteiner hela primat hjärnan är möjligt genom att anställa ny vävnad inbäddning och snittning metoder i kombination med användning av kreativa apparater för parti färgning av flera fritt flytande sektioner vid en viss tidpunkt.
Abstract
Immunohistokemi (IHC) är en av de mest använda Laboratoriemetoder för detektion av målproteiner
Protocol
Immunohistochemisty är en av de mest använda metoder för karakterisering av protein uttryck i hjärnan av olika experimentella djurmodeller. Det är relativt lätt att genomföra systematiska immunhistokemiska procedurer på hjärnan hos gnagare och andra vanliga experimentella modeller med liknande hjärnans storlek. Det finns dock inga publicerade arbete för att vår kunskap som ger en övergripande redogörelse för hur att utföra sådana immunodetection förfaranden i en hel apa hjärna. Här följer en detaljerad beskrivning av hur man förbereder en hel apa hjärna för storskalig immunhistokemisk detektion av olika målproteiner. Detta arbete har vuxit fram som ett resultat av samarbete mellan kommersiella och akademiska strävanden. Som sådana detaljer angående vävnad inbäddning och snittning förbli en egen kunskap om NSA.
Del 1: djur och vävnad förberedelse
Hjärnan av en vuxen grön markatta (Cercopithecus aethiops) används för detta protokoll. Alla förfaranden utförs i enlighet med den kanadensiska rådet om Djurvård (CCAC) riktlinjer för användning och skötsel av djur i biomedicinsk forskning 1.
- Animal är djupt sederad med ketamin hydroklorid (10 mg / kg im), avlivas med en överdos av natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) och perfusion transcardially med 0,1 M PBS tills det är helt exsanguinated.
- Detta följs av en 4% paraformaldehyd lösning i PBS i 5 min (~ 1 liter).
- Den externaliserats hjärnan är placerad i graderade PBS-buffrad sackaros lösningar (10, 20 och 30%, i följd) som innehåller 0,02% natriumazid och underhålls på 4 ˚ C tills hjärnan sjunker till botten av behållaren. Lösningen ska ersättas med några dagar tills hjärnan genomgår freeze-snittning.
- Hjärnan skickas till Neuroscience Associates (NSA, Knoxville, TN) att utsättas för deras egen MultiBrain ™ inbäddning och frys-sektionering teknik.
- Sju (7) anpassning landmärken placeras i inbäddning matrisen så att avsnitten kan vara inriktad på rätt sätt (dvs vänster-höger-orientering) och åter anpassat efter histologisk bearbetningen är klar.
- Den frysta block är digitalt fotograferad på blocket ansiktet innan varje seriell avsnitt hämtas från blocket. Digitala bilder samt avsnitten från den här hjärnan kan senare användas för 3D-rekonstruktion av anatomiska och histologiska kartor, respektive.
- Serial fritt flytande koronalt sektioner, med en tjocklek på 50 ìm per sektion, samlas in från hela hjärnan.
Del 2: Histologisk bearbetning
§ § väljs vid en given rumslig intervall (t.ex. 500-mikrometer) och för våra försök har bearbetats med följande antikroppar: bräcklig-X psykisk utvecklingsstörning protein (FMRP, Chemicon, Temecula, Kalifornien), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc.; Baltimore, MD), och Neun (Chemicon, Temecula, Kalifornien). FMRP är ett cytoplasma protein som rikligt förekommer i nervceller i normal och permutation bärare hjärnor 2. Neun (Neuronal kärnor) erkänner specifikt DNA-bindande neuron-specifikt protein Neun som finns i de flesta nervceller och distribueras i neuronala kärnor, perikarya och några proximal neuronala processer 3. SMI-32 är en monoklonal antikropp som känner igen den icke-fosforyleras epitop på neurofilament protein 4.
- Med ett intervall på 500 ìm, är cirka 140 avsnitt används per antikropp.
- Alla inkubationer, tvättar och steg färgning sker med mild omskakning med hjälp av specialiserade färgning rätter och korgar (HistoTools, Knoxville, TN).
- Avsnitten är först inkuberas i en lösning innehållande 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% normala hes serum (NHS) i 60 min för att minska icke-specifik bindning av antikroppar och resulterande bakgrundsfärgning.
- Avsnitten markerade för FMRP immunfärgning genomgå ytterligare ett steg av antigen återhämtning med hjälp av Solution Antigen avslöja (Vector Labs, San Francisco) enligt leverantörens anvisningar.
- Avsnitten är sedan inkuberas över natten och på separata dagar i sina respektive antikroppar lösningar innehållande 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS (med en utspädningsfaktor på 1 / 5, 000 för FMRP och SMI-32 och 1 / 2, 000 för Neun antikroppar.
- Nästa dag är delar tvättas för tre 10-min perioder i tvätt-lösning (0,1 M PBS/0.3% TX), följt av inkubering under 2 h vid rumstemperatur i biotinylerad anti-mus sekundär antikropp som togs upp i häst (Vector Labs, 1 / 1000 spädning i 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS).
- Efter ytterligare en uppsättning av tre 10-min tvättar, är de avsnitt placeras i en lösning av avidin-biotin konjugerad pepparrotsperoxidas komplex (Vector Labs) för 1 timme i rumstemperatur.
- Slutligen, efter en annan uppsättning tvättar, är de delar som utsätts för 10 min till en nickel förbättrade diaminobenzidine (Ni-DAB) reaktion som ger en mörkblå fläck inom immunoreaktiva nervceller.
- Vid slutförandet av histologiska förfarandet är sektioner monteras på gelatin-belagt glas diabilder.
- Alla delar är lufttorkat natten och täckas enligt gällande rutiner.
Del 3: representativa resultat:
Denna metod ger en komplett uttryck profil av ett målprotein av intresse i ett helt apa hjärna. Här visar vi representativ koronalt avsnitt som ger en ögonblicksbild av FMRP, Neun och SMI32 uttryck i samma apa hjärnan.
Figur 1: Färgning skål (A) och basket (B) som används för storskalig satsvis bearbetning av fritt flytande sektioner för immunodetection.
Figur 2: Representant koronala delar från en grön markatta hjärna färgas för FMRP (A), Neun (B) och SMI32 (C)-antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två viktiga steg i detta förfarande som gör storskalig detektion av proteiner i en hel apa hjärna möjligt. En är inbäddning och snittning protokoll, som fortfarande är patentskyddade kunskaper i NSA. Den andra är användningen av färgning rätter och korgar som HistoTools. Det senare möjliggör enkel och snabb hantering av många (~ 40) sektioner vid en viss tidpunkt. Det ger också medel för enhetligt behandla alla delar i hjärnan och ger en vetenskapligt sund histologisk behandling. Dessutom ger användning av inbyggda landmärken dessutom fördelen av att kunna digitalt förvärva färgningsmönster av torkade och täckas diabilder och att utsätta de digitaliserade filerna till olika former av analyser. Även om vi ger exempel på tre antikroppar, kan förfarandet tillämpas på en rad andra målproteiner samt histologisk fläckar, särskilt de som avslöjar cytoarchitecture olika kortikala områden och därmed användas för kartläggning ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Frank Ervin, Roberta Palmour och personalen i beteendevetenskaper stiftelsen Laboratories i St Kitts, Västindien, för deras fortsatta stöd i vårt primat arbete. Detta arbete stöddes av ett stipendium från Fragile X Research Foundation i Kanada (FXRFC) för att SZ och - verksamhetsbidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (AC) och National Engineering och Research Council of Canada (MP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon International | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon International | MAB377 | N/A |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
References
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
