Biology

माउस अधिवृक्क Chromaffin सेल अलगाव

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

अधिवृक्क दिमाग़ी chromaffin सेल संस्कृति प्रणालियों इन विट्रो सेटिंग में में उत्तेजना के स्राव युग्मन के अध्ययन के लिए अत्यंत उपयोगी हैं. इस प्रोटोकॉल adrenals काटना और फिर दूर आधिवृक्क प्रांतस्था विपठ्ठन द्वारा मस्तिष्क का क्षेत्र अलग करने के लिए विधि का इस्तेमाल किया दिखाता है. एकल chromaffin कोशिकाओं में मज्जा के पाचन में फिर दिखा दिया है.

Abstract

Protocol

लघुरूप:
अधिवृक्क Chromaffin कक्ष, ई. सोल्यूशन - एनजाइम समाधान, ई. DMEM - समृद्ध Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम ACCs

तैयार
1. ई. सोल्यूशन (40 इकाइयों papain / 1ml ई. सोल्यूशन) के वांछित मात्रा papain जोड़ें.
2. Carbogen के साथ बर्फ पर के बारे में 15 मिनट के लिए सक्रिय papain. बर्फ पर आक्सीजन के साथ मिलना लोके बफर के रूप में अच्छी तरह से.
विच्छेदन
1. 8-10 सप्ताह माउस का प्रयोग करें.
2. पाचन के लिए पिछले हटायें लोके बफर और बर्फ पर जगह oxygenated.
3. विच्छेदन प्रक्रिया के लिए वीडियो देखें.
4. एक बार excised में जगह ग्रंथियों लोके बफर oxygenated.
ग्रंथि की तैयारी
1. ग्रंथि से वसा निकालें.
2. ग्रंथि से प्रांतस्था पट्टी.
Enzymatic पाचन
1. बाँझ फिल्टर papain oxygenated.
2. एक पेट्री डिश पर oxygenated papain के चार पूल बनाओ.
  1. 3 पूल 100uls के बारे में होना चाहिए.
  2. 1 पूल के बारे में 400uls होना चाहिए.
3. पूल के माध्यम से medullae धो
  1. 1 3 100ul पूल के माध्यम से.
  2. फिर 400ul पूल के माध्यम से
  3. Microfuge ट्यूब में Pippette 300ul ई. सोल्यूशन और मज्जा 400ul पूल से टुकड़े.
  4. 37 में microfuge ट्यूब और जगह पर Qrap parafilm सी 20min के लिए पानी के स्नान °
  5. के लिए आक्सीजन के साथ मिलना शेष ई. papain युक्त सोल्यूशन जारी रखने के लिए याद रखें.
  6. के बाद 20 बाँझ फिल्टर अधिक ई. सोल्यूशन मिनट.
  7. नव फ़िल्टर ई. सोल्यूशन के साथ पुराने ई. सोल्यूशन स्नान medullae बदलें.
Triturations
1. Aspirate और त्यागें ई. सोल्यूशन.
2. 1ml ई. DMEM में medullae धो लें.
3. Aspirate और ई. DMEM त्यागें.
4. 1ml टिप के साथ 300ul ई. DMEM और triturate 20X जोड़ें.
5. बाँझ रेजर ब्लेड के साथ 200ul टिप कट.
6. कटौती 200ul टिप के साथ 5-10X Triturate.
7. ई. DMEM स्नान medullae टुकड़े त्यागें. मध्यम मलबे में शामिल होंगे.
8. 300uls ताजा ई. DMEM जोड़ें टुकड़े medullae.
9. 200ul 20x टिप के साथ Triturate
10. Pippette ई. DMEM ट्यूब withough medullae टुकड़े microfuge. मध्यम मुक्त ACCs शामिल होंगे.
11. 300uls ताजा ई. DMEM जोड़ें टुकड़े medullae.
12. 23.5 गेज सिरिंज सुई 20x के साथ medullae Triturate.
13. दोनों triturations से ई. DMEM मिश्रण. Medullae टुकड़े मौजूद नहीं हो सकता है और अब एक featherlike उपस्थिति होनी चाहिए चाहिए.
चढ़ाना
1. 2.5 मिनट के लिए पिछले दो 3.7g एस पर trituration कदम से Microfuge ई. DMEM
2. 50uls-200 ई. DMEM में Resuspend गोली बाद में प्रयोगों के आधार पर.
3. एक गिलास coverslip पर 10 30uls प्लेट.
4. पालन कोशिकाओं के लिए 15 मिनट रुको.
5. ई. DMEM के 750uls जोड़ें.