Biology

עכבר בידוד הכליה Chromaffin Cell

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

לשד הכליה תרבות chromaffin מערכות סלולריים הם מאוד שימושי לחקר צימוד עירור הפרשת ב-בקביעת חוץ גופית. פרוטוקול זה ממחיש את שיטת לנתח את יותרת הכליה ואז לבודד את האזור מדולרי ידי הפשטת משם קליפת יותרת הכליה. מערכת העיכול של לשד לתוך אחד התאים chromaffin מודגם אז.

Abstract

Protocol

קיצורים:
Accs - הכליה תאים Chromaffin, א Soln - פתרון אנזימים, א DMEM - השתנה מועשר Dulbecco הנשר בינוני

הכנה
1. הוסף papain הכמות הרצויה של ה Soln (40 יחידות papain / 1ml Soln א.).
2. הפעל papain עם carbogen כ -15 דקות על הקרח. לוק של חמצן חיץ על הקרח גם כן.
בתור
1. השתמש בעכבר שבוע 8-10.
2. לפני העיכול להסיר מחומצן חיץ של לוק ומניחים על קרח.
3. עיין וידאו הליך לנתיחה.
4. נכרת ברגע, בלוטות מקום מחומצן חיץ של לוק.
הכנה של בלוטת
1. הסרת שומן מבלוטת.
2. רצועת קליפת מבלוטת.
עיכול אנזימתי
1. סינון סטרילי מחומצן papain.
2. הפוך את ארבע בריכות של papain מחומצן על צלחת פטרי.
  1. 3 בריכות צריך להיות בערך 100uls.
  2. 1 הבריכות צריך להיות בערך 400uls.
3. לשטוף medullae דרך בריכות
  1. 1 דרך 3 בריכות 100ul.
  2. ואז דרך הבריכה 400ul
  3. Pippette 300ul א Soln ואת לשד חלקים ממאגר 400ul לתוך צינור microfuge.
  4. Qrap parafilm ברכבת התחתית microfuge ומניחים 37 ° C אמבט מים 20min.
  5. זכור להמשיך חמצן הנותרים א Soln המכיל papain.
  6. לאחר 20 דקות לסנן סטרילי יותר E. Soln.
  7. החלף medullae בן ה Soln רחצה עם מסוננים החדש E. Soln.
Triturations
1. לשאוב ולזרוק א Soln.
2. לשטוף medullae ב 1ml א DMEM.
3. לשאוב ולזרוק א DMEM.
4. הוסף 300ul א DMEM ו triturate 20X עם קצה 1ml.
5. חותכים קצה 200ul עם סכין גילוח סטרילית.
6. Triturate 5-10X עם קצה 200ul לחתוך.
7. מחק ה medullae DMEM חתיכות ים. בינוני יכיל פסולת.
8. הוסף 300uls טרי E. DMEM כדי medullae חתיכות.
9. Triturate עם קצה 200ul 20x
10. Pippette א DMEM כדי microfuge צינור withough חתיכות medullae. בינוני יכיל Accs חינם.
11. הוסף 300uls טרי E. DMEM כדי medullae חתיכות.
12. Triturate medullae עם מחט מזרק 23.5 מד 20x.
13. שלב א 'DMEM מ triturations שניהם. חתיכות Medullae לא צריך להיות נוכח צריך עכשיו יש הופעה נוצה.
ציפוי
1. Microfuge א DMEM משני הצעדים האחרונים טחינה דקה עבור 2.5 דקות 3.7g s.
2. Resuspend גלולה ב 50uls-200 E. DMEM, תלוי בניסויים הבאים.
3. פלייט 10-30uls על coverslip זכוכית.
4. חכה 15 דקות עבור תאים לדבוק.
5. הוסף 750uls של E. DMEM.