Biology

鼠标肾上腺嗜铬细胞分离

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

肾上腺髓质嗜铬细胞培养系统，在体外设置为激发分泌耦合研究是非常有用的。该协议说明了用于解剖肾上腺然后隔离剥离肾上腺皮质髓质地区的方法。髓质消化成单个的嗜铬细胞，然后证明。

Abstract

Protocol

缩写：
行政协调会 - 肾上腺嗜铬细胞，大肠杆菌Soln - 酶液，大肠杆菌的DMEM - 丰富贝科的改良Eagle培养基

制备
1. 添加木瓜蛋白酶所需的数量E. Soln（40个单位木瓜/1毫升E. Soln）。。
2. 与carbogen激活木瓜蛋白酶在冰约15分钟。含氧洛克的缓冲区，以及在冰上。
解剖
1. 使用8-10星期鼠标。
2. 在此之前消化除去含氧洛克的缓冲区，并置于冰上。
3. 清扫程序，请参阅视频。
4. 一旦切除，地方腺体含氧洛克的缓冲区。
腺的制备
1. 删除从腺体脂肪。
2. 地带从皮质腺。
酶消化
1. 无菌过滤器含氧木瓜。
2. 培养皿四个含氧木瓜池。
  1. 3个游泳池应约100uls。
  2. 1池应约400uls。
3. 通过池洗净medullae
  1. 第一，通过3 100ul池。
  2. 然后通过400ul池
  3. Pippette 300ul 400ul池E. Soln和髓质到离心管件。
  4. Qrap离心管和地方的封口膜在37 ° C下20分钟的水浴。
  5. 请记住要继续剩余的氧气大肠杆菌Soln含有木瓜蛋白酶。
  6. 20分钟后，无菌过滤大肠杆菌Soln。
  7. 更换新的过滤E. Soln E. Soln洗澡medullae。
Triturations
1. 吸丢弃大肠杆菌Soln。
2. 在1毫升大肠杆菌的DMEM清洗medullae。
3. 吸丢弃大肠杆菌的DMEM。
4. 用1ml提示添加300ul E. DMEM和磨碎20X。
5. 用无菌刀片剪切200ul提示。
6. 磨碎5 - 10X与削减200ul提示。
7. 放弃E. DMEM洗澡medullae件。中期将包含碎片。
8. 添加新鲜的大肠杆菌的DMEM 300uls medullae件。
9. 磨碎用200ul提示20X
10. Pippette E. DMEM培养液到离心管withough medullae件。中期将包含免费的行政协调。
11. 添加新鲜的大肠杆菌的DMEM 300uls medullae件。
12. 磨碎用23.5号注射器针头20X medullae。
13. 结合来自triturations E. DMEM培养液。 Medullae件不应该存在的，现在应该有一个featherlike外观。
电镀
1. 从最后两个步骤2.5分钟trituration3.7克第离心大肠杆菌的DMEM
2. 50uls - 200大肠杆菌的DMEM悬浮颗粒，取决于后续实验。
3. 盘上的玻璃盖玻片10 30uls。
4. 等待细胞坚持15分钟。
5. 添加大肠杆菌的DMEM 750uls。