Biology

Fare Adrenal Kromafin Hücre İzolasyonu

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Adrenal medüller kromafin hücre kültürü sistemleri, in vitro ortamda bir uyarım-salgılanması kaplin çalışması için son derece yararlı. Bu protokol adrenaller incelemek ve sonra Adrenal korteks uzak sıyırma medüller bölgede izole etmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Tek kromafin hücrelerine medulla sindirim sonra gösterilmiştir.

Abstract

Protocol

Kısaltmalar:
TKK - Adrenal Kromafin Hücreler, E. Soln - Enzim Çözüm, E. DMEM - Zenginleştirilmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta

Hazırlık
1. E. Soln (40 adet papain / 1 ml E. Soln.) Istenilen miktar papain ekleyin.
2. Carbogen ile yaklaşık 15 dakika boyunca buz üzerinde papain etkinleştirin. Oxygenate Locke buz tampon olarak.
Diseksiyon
1. 8-10 hafta fareyi kullanın.
2. Kaldırmak sindirim önce Locke'un tampon ve buz üzerinde yer oksijenli.
3. Diseksiyon işlemi için video bakın.
4. Eksize sonra, yer bezleri Locke'un tampon oksijenli.
Bezinin hazırlanması
1. Yağ bezi çıkarın.
2. Bezinin korteks Şeridi'nde.
Enzimatik Sindirim
1. Steril filtre papain oksijenli.
2. Petri oksijenli papain dört havuzları olun.
  1. 3 havuzları 100uls ilgili olmalıdır.
  2. Havuzlarının 1 400uls ile ilgili olmalıdır.
3. Medullae havuzları ile yıkayın
  1. 1. 3 100ul havuzları ile.
  2. Bundan sonra 400ul havuzu ile
  3. Mikrofuge'de tüpe 400ul havuzu Pippette 300ul E. Soln ve medulla adet.
  4. Mikrofuge'de tüp ve yer Qrap parafilm 37 ° C su banyosunda 20 dk.
  5. Papain içeren oksijen kalan E. Soln devam etmeyi unutmayın.
  6. 20 dakika sonra steril filtre E. Soln.
  7. Yeni süzülmüş E. Soln eski E. Soln banyo medullae değiştirin.
Triturations
1. E. Soln aspire edin ve atın.
2. 1ml E. DMEM medullae yıkayın.
3. E. DMEM aspire edin ve atın.
4. 1ml ucu 300ul E. DMEM ve çiğnemek 20X ekleyin.
5. 200ul ucu steril bir jiletle kesin.
6. Kesme 200ul ucu ile 5-10X Karışım.
7. E. DMEM banyo medullae parçaları atın. Orta enkaz içerecektir.
8. Adet medullae 300uls taze E. DMEM ekleyin.
9. 200ul ucu 20x ile Karışım
10. Pippette E. DMEM tüp withough medullae adet mikrofuge'de. Orta ücretsiz TKK içerecektir.
11. Adet medullae 300uls taze E. DMEM ekleyin.
12. 23.5 göstergesi şırınga iğnesi 20x medullae Karışım.
13. E. hem triturations DMEM birleştirin. Medullae parçaları olmamalı ve şimdi bir kuş tüyü bir görünüme sahip olmalıdır.
Kaplama
1. 3.7g s 2.5 dakika için son iki öğütme adımları mikrofuge'de E. DMEM
2. 50uls-200 E. DMEM sonraki deneyler bağlı olarak yeniden süspanse pelet.
3. Plaka, bir cam lamel 10-30uls.
4. Uymaları hücreleri için 15 dakika bekleyin.
5. E. DMEM 750uls ekleyin.